УДК 547.92;579.222
ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ СТЕРОИДОВ МИЦЕЛИЕМ Curvularia lunata В ПРИСУТСТВИИ МЕТИЛ-р-ЦИКЛОДЕКСТРИНА
© 2011 г. В. А. Андрюшина, А. В. Дружинина, В. В. Ядерец, Т. С. Стыценко, Н. Е. Войшвилло
Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 e-mail: verayaderetz@yandex.ru Поступила в редакцию 18.09.2009 г.
С помощью мицелия Curvularia lunata, суспендированного в фосфатном буфере с метил-Р-циклодекс-трином (МЦД), трансформировано 16 А 5-3р-гидрокси- и Л4-3-кетостероидов ряда андростана и прегна-на. Выделено 20 моногидрокси- и дигидроксипродуктов, структура которых установлена с помощью спектров протонно-магнитного резонанса и масс-спектров. Гидроксилирование Л5-3р-гидроксистеро-идов осуществлялось преимущественно в положение 7а, тогда как гидроксилирование Л4-3-кетостеро-идов — в положение 11 р. Исключение составили андрост-4-ен-3,17-дион, 9а-гидроксиандростендион и андроста-1,4-диен-3,17-дион, гидроксилирование которых происходило в основном в положение 14а. При трансформации прогестерона и гидроксиметилпрегнадиенона, помимо основных 11р-производ-ных, выделены бр- и 7р-гидроксипроизводные с выходом 10 и 30% соответственно. МЦД использовали в отношении к трансформируемому стероиду 1 : 1 (моль/моль). При максимальной концентрации кор-тексолона 20 г/л и ацетата андростенолона 10 г/л в присутствии МЦД получены соответственно гидрокортизон и 7а-гидроксиандростенолон с выходом 55 и 77%. В отсутствие МЦД наблюдались адсорбция стероидов на мицелии, более низкая скорость их трансформации, невысокие концентрации модифицируемых субстратов и низкий выход соответствующих гидроксипроизводных.
В промышленном синтезе лекарственных препаратов стероидной природы необходимыми этапами являются модификации стероидной молекулы с помощью микроорганизмов (гидроксилирование, 1,2-дегидрирование, расщепление боковой цепи стеринов и др.) [1—4]. Их преимущество перед химическими реакциями заключается в высокой регио- и стереоспецифичности и экологичности. Однако при проведении указанных биотрансформаций, вследствие ничтожной растворимости стероидов в водной среде (несколько мг/л), существует проблема повышения доступности стероидных субстратов к микробной клетке и увеличения их содержания в реакционной среде [1—3].
Способ диспергирования стероидов в культу-ральной жидкости с помощью смешивающихся с водой органических растворителей лишь частично решает проблему и только при трансформации так называемых "гидрофильных" стероидов. По сравнению с ним способ применения стероидов в виде
Сокращения: АД — андростендион, АДД — андростадиен-дион, ДЭА — дегидроэпиандростерон (андростенолон), АДЭА — ацетат ДЭА, ДГА — 3ß,17ß-дигидроксиандрост-5-ен, ТГА — 3ß,7a,17ß-тригидроксиандрост-5-ен, Д5-ПГ — прегненолон, Д4-ПГ —прогестерон, 17-ОН-Д4-ПГ — 17ß-гидроксипрогестерон, 16,17-эпокси-Д4-ПГ — 16a,17a-эпоксипрогестерон, в-во "S" — кортексолон (вещество "S" Рейхштейна), в-во "F" — гидрокортизон (вещество "F" Кендалла), MAR и ТАК — моно- и триацетат вещества "R" Рейхштейна, ГМПД — 21-гидрокси-20-метилпрегна-1,4-диен-3-он, ЦД — ß-циклодекстрин, МЦД — метил^-цик-лодекстрин, ГПЦД — гидроксипропил^-циклодекстрин.
водной суспензии с размером частиц не более 10 мкм дает возможность увеличить содержание стероидных субстратов до 50 г/л [1, 2]. Но этот способ не пригоден для процессов, в которых стероидный субстрат или продукт его трансформации токсичны для микроорганизма. Например, андростадиендион (АДД), образуемый при отщеплении боковой цепи стеринов, токсичен для бактерий в концентрации выше 0.8 г/л [5].
Высоких концентраций стероидных субстратов удается достичь, используя способ, предложенный в 1981 г. учеными фирмы Гедеон Рихтер ("Gedeon Richter", Венгрия), а именно, трансформации стероидов, солюбилизированных в водных средах с помощью макроциклических а, ß, у-циклодекстринов [6, 7]. Указанные циклодекстрины, главным образом ß-циклодекстрин (ЦД), образуют со стероидами растворимые в воде комплексы, что позволяет увеличить содержание стероидов в трансформационной среде до 10 г/л [8]. Наличие ЦД в реакциях гидроксилирования, 1,2-дегидрирования, восстановления 17-кетогруппы стероидов и окисления Д5-3ß-гидроксистероидов в Д4-3-кетостероиды, катализируемых свободными или иммобилизованными клетками бактерий и грибов, в 2 раза сокращало время трансформации, способствовало повышению выхода продуктов реакции и в некоторых случаях изменяло их соотношение [9—15].
При замене ЦД его химически модифицированными производными — метил-ЦД (МЦД), гидрок-
сипропил-ЦД (ГПЦД) и др. — содержание стероидов в водной среде составило не менее 20 г/л. При такой нагрузке с помощью актинобактерий осуществлены 1,2-дегидрирование гидрокортизона и андростендиона, а также отщепление боковой цепи стеринов [16—18]. Данные гидроксилирования стероидов грибами в присутствии химически модифицированных циклодекстринов в литературе отсутствуют [1—4, 6, 19].
Цель работы — гидроксилирование с помощью штаммов гриба Curvularia lunata Д5-3ß-гидрокси- и Д4-3-кетостероидов ряда андростана и прегнана в виде комплексов с метил^-циклодекстрином.
МЕТОДИКА
Трансформации Д5-3ß-гидроксистероидов выполняли с помощью гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 [20], трансформации Д4-3-кетостероидов — с помощью Curvularia lunata ВКПМ F-988 [21]. Для со-любилизации трансформируемых стероидов использовали ß-циклодекстрин (ЦД), метилированный по случайным положениям ß-циклодекстрин (МЦД) и гидроксипропил^-циклодекстрин — (ГПЦД), Китай. Отношение циклодекстринов к трансформируемому стероиду составляло 1 : 1 (моль/моль).
Культивирование и трансформацию стероидов проводили в конических колбах объемом 750 мл, при 28°С, на качалке — 220 об/мин; культивирование — в 100 мл питательной среды, трансформацию — в 75 мл 1/15 М фосфатного буфера. Штамм F-981 выращивали на среде (г/л): сахароза — 30.0, дрожжевой автоли-зат - 2.5, NaNO3 - 2.0, K2HPO4 - 1.0, (NH4)H2PO4 -3.0, KCl - 0.55, MgSO4 • H2O - 0.5, рН 6.0-6.3 (среда I). Штамм F-988 выращивали на среде (г/л): глюкоза -20.0, пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевая мука - 10.0, KH2PO4 - 4.0, рН 6.0-6.3 (среда II).
Среды засевали суспензией спор грибов, выращенных в течение 7-10 сут на скошенном агаре, приготовленном на основе среды для штамма F-981. Культивирование 1 генерации осуществляли 3 сут и использовали в качестве посевного материала, который вносили в свежую среду (I или II). Через 32-34 ч роста мицелий отделяли от среды и суспендировали в буферном растворе в количестве 9.5-19.0 г/л (в пересчете на вес сухой биомассы), в который предварительно вносили циклодекстрин и микрокристаллический стероид. Полученную суспензию распределяли в несколько колб. Через определенные интервалы инкубации отбирали пробы в количестве не менее 5 мл, которые экстрагировали этилацетатом.
Анализ продуктов трансформации. Качественный анализ продуктов трансформации проводили с помощью ТСХ, для чего использовали пластинки Silufol UV 254 ("Kavalier", Чехословакия) и Sorbfil ("Imid Ltd", Россия). Разделение стероидных со-
единений проводили в системе растворителей ацетон—хлороформ (7 : 3). После разделения продуктов трансформации Д5-3р-гидроксистероидов хро-матограммы проявляли 1%-ным раствором ванилина в 10%-ном растворе водной хлорной кислоты; визуальную оценку продуктов трансформации Д4-3-кетостероидов проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм.
Для определения содержания исходных Д5-3р-гидроксистероидов и продуктов их трансформации этилацетатный экстракт упаривали досуха, взвешивали и определяли процентное содержание стероидов в пробах с помощью спектра протонно-магнит-ного резонанса. Содержание в реакционной смеси Д4-3-кетостероидных субстратов и продуктов их трансформации оценивали с помощью ВЭЖХ [20].
Выделение продуктов гидроксилирования. После окончания трансформации мицелий отделяли и проверяли его на наличие стероидных соединений. При их отсутствии экстрагировали этилацетатом только водную фракцию до полного извлечения стероидов. Экстракт упаривали. Если мицелий содержал продукты трансформации, его также экстрагировали этилацетатом. Экстракты объединяли и упаривали в вакууме. Полученный остаток промывали эфиром и отфильтровывали кристаллические продукты, выход (В) которых рассчитывали по формуле: В = 100 х Мп/Мс х (Мпр/Мсб), где Мп - масса выделенного кристаллического продукта, Мс — количество взятого в реакцию субстрата, М^ — молекулярная масса продукта, Мсб — молекулярная масса субстрата.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гидроксилирование А5-3р-гидроксисгероидов. На
схеме (рис. 1) видно, что все Д5-3р-гидроксистерои-ды (дегидроэпиандростерон (ДЭА), ацетат ДЭА (АДЭА), 3р,17р-дигидроксиандрост-5-ен (ДГА) и его 3р-ацетат, прегненолон (А5-ПГ), 16а,17а-эпокси-прегненолон (16,17-эпокси-А5-ПГ), моноацетат и триацетат вещества "Я" Рейхштейна (МАИ и ТАК) после трансформации с помощью мицелия Curvular-ia lunata ВКПМ Б-981 содержат 7а-гидроксигруппу.
Хорошо известна способность различных штаммов C. lunata к 11р-гидроксилированию и к 14а-гид-роксилированию некоторых Д4-3-кетостероидов [1—4, 22], но способность этого вида к селективному 7а-гидроксилированию Д5-3р-гидроксистеро-идов показана нами впервые [20].
Трансформация дегидроэпиандростерона (ДЭА). При нагрузке ДЭА или АДЭА в количестве 2 г/л, внесенных в буферный раствор в виде мелкокристаллической суспензии, полная конверсия в 7а-гидрокси-ДЭА происходила с помощью 10 г/л мицелия (в пересчете на вес сухой биомассы) за 24 и 20 ч соответственно (рис. 2); 7а-гидроксилирова-
CH3
RO
CH3
OH
HO ^ - "OH R = H-ДЭА 7-ОН-ДЭА
R = Ас-АДЭА
HO
'OH HO
ТГА
HO
CH
OH
ДГА
= O
HO " "OH O ^ v O'
Прегненолон 7,11-ОН-прегненолон 11-ОН-прогестерон Прогестерон
CH2OR2 = O 11OR3
HO
ORi
R1 = R2 = R3 = H-В-во "R" R1 = R3 = H, R2 = Ac-MAR R1 = R2 = R3 = Ac-TAR
CH2OH — O '"OH
CH2OH
OH
7-ОН-в-во "R"
АДД
14-ОН-АДД
CH2OH O "IIOH
O ^ ^ O
В-во "F"
H3CV___^CH2OH
CH3
В-во "S"
OH
7-ОН-ГМПД
H3CV___^CH2OH
CH3I ♦
O- ^ — O'
11-ОН-АДД 11-ОН-ГМПД
H3CV___^CH2OH
CH3
ГМПД
Рис. 1. Схема гидроксилирования стероидов штаммами Curvularia lunata.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.