ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2008, том 50, № 4, с. 589-598
СИНТЕЗ, ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ
УДК 541.64:547.466
ГИПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫЙ ПОЛИЛИЗИН, МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПО КОНЦЕВЫМ АМИНОГРУППАМ ЛИЗИНА ОСТАТКАМИ ГИСТИДИНА: СИНТЕЗ И СТРУКТУРА1
© 2008 г. Г. П. Власов*, А. П. Филиппов*, И. И. Тарасенко*, Е. Б. Тарабукина*, Г. А. Панкова*, И. Е. Ильина*, А. А. Шпырков*, Е. В. Скворцова**, А. И. Скворцов**, В. И. Воробьев**
*Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 **Институт цитологии Российской академии наук 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4 Поступила в редакцию 26.02.2007 г. Принята в печать 27.11.2007 г.
С целью регулирования молекулярной массы и размера гиперразветвленного полилизина, а также возможности модификации аминогрупп его N-концевых лизиновых остатков разработан метод синтеза полимера полимеризацией N-карбоксиангидрида №-карбобензоксилизина в условиях восстановительного удаления №-карбобензоксигруппы действием водорода над активированным палладием в присутствии обрывателя полимеризации - активированного эфира №-трет-бутилоксикар-бонилгистидина. Структура полученных полимеров изучена методами капиллярного электрофореза, кругового дихроизма и молекулярной гидродинамики.
Создание полимерных носителей биологически активных веществ - одно из приоритетных направлений развития химии высокомолекулярных соединений. Последние десять лет отмечены, в частности, значительным интересом к созданию полимерных носителей, способных обеспечить целевую доставку ДНК в ядро клетки [1] для решения задач генной терапии. В ходе исследований был определен круг наиболее перспективных носителей ДНК, отличительной особенностью которых является то, что все они являются поликатионами и их структура близка сферической. Среди таких носителей оказались лизиновые и полиамидоаминные дендримеры [2-9], разветвленный полиэтиленимин [10, 11] и катионные ли-посомы [12, 13]. Линейный полилизин также мо-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 04-03-33032, 05-03-33152) и Гранта государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-1823.2003.3), Программы фундаментальных исследований Отделения химии наук о материалах РАН "Создание и изучение макромолекул и макромолекулярных структур новых поколений".
E-mail: gpvlasov@hq.macro.ru (Власов Геннадий Петрович).
жет быть использован для связывания и компак-тизации ДНК при ее доставке в ядро клетки [14], но уровень трансфекционной активности ДНК в комплексе с линейным полилизином низкий. Было найдено, что усиление трансфекционной ДНК-активности комплекса линейного полилизина с ДНК может быть достигнуто при модификации его боковых №-аминогрупп остатками ги-стидина [15]. В настоящее время принято, что носители ДНК должны быть биосовместимыми, биодеградирующими и неиммуногенными [16]. Среди перечисленных выше носителей ДНК этим требованиям полностью отвечают только лизиновые дендримеры, в то время как биосовместимость и биодеградирумость полиамидоамин-ных дендримеров, тем более разветвленного по-лиэтиленимина и катионных липосом, не только весьма сомнительна, но и в принципе невозможна, что проявляется, в частности, в токсичности указанных носителей [17, 18]. Однако возможность практического использования лизиновых дендримеров ограничивается проблемами их син-
Таблица 1. Условия синтеза гиперразветвлеииых полилизииов, модифицированных гистидином, и их строение по данным аминокислотного анализа
Полимер Соотношение К-карбоксиангидрид-лизина : активированный эфир гистидина Мольное соотношение Мольное соотношение К-концевых аминокислот
массовое мольное лизин : гистидин* (лизин : гистидин)**
1 1 : 1 1.8 5.6 1 : 34
2 10 : 1 17.5 75.3 1 : 14
* По данным аминокислотного анализа и ** капиллярного электрофореза.
теза [19] - обычно дендримеры получают с использованием достаточно трудоемких и длительных методик пептидного синтеза, классического синтеза [4], при синтезе в растворе, твердофазного синтеза [6, 8], при синтезе на полимерном носителе.
Недавно нами был предложен практически одностадийный метод получения гиперразветв-ленных полиаминокислот на основе лизина полимеризацией К-карбоксиангидрида №-карбобен-зоксилизина в условиях восстановительного удаления защитной №-карбобензоксигруппы при действии водорода в присутствии активированного палладия [20]. Изучение полученных соединений показало, что их структура близка к структуре ли-зиновых дендримеров [19]. Сравнение трансфек-ционной активности ряда сферических носителей [9] (звездообразные конъюгаты белков, лизи-новые дендримеры и их полимерные звездообразные конъюгаты, гиперразветвленный полилизин и гиперразветвленный полилизин, модифицированный по концевым аминогруппам гистидином) показало, что среди исследованных носителей трансфекционная активность комплекса ДНК с модифицированным гистидином гиперразветвленным полимером является максимальной и приближается к активности такого хорошо изученного носителя ДНК, как полиэтиленимин, выгодно отличаясь от него биосовместимостью, неиммуногенно-стью и нетоксичностью. В настоящей работе
изложены сведения о синтезе гиперразветвлен-ного полилизина, модифицированного по концевым аминогруппам остатками гистидина, и об его структуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез гиперразветвленного полилизина, модифицированного по И-концевым аминогруппам гистидином
Для получения указанного соединения на стадии синтеза мы использовали специально полученный регулятор полимеризации К-карбоксиан-гидрида №-карбобензоксилизина, а именно, пен-тафторфениловый эфир Ка-трет-
бутилоксикарбонил(К1т-бензилоксиметил)гисти-дина (ВОС-Ы18(1Ч1т-Вот)-ОРРР), ^-защитная группа которого устойчива в условиях каталитического гидрирования. Синтез гиперразветвленного полилизина с одновременным регулированием его ММ и модификацией концевых аминогрупп проводили по аналогии с работой [20] в условиях каталитического восстановительного удаления №-карбобензоксизащитной группы с К-карбоксиангидрида №-карбобензоксилизина при действии газообразного водорода в присутствии активированного палладия и обрыванием процесса полимеризации К-карбоксиангидрида:
О
II
Ш-С-О-СН;
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I О=С-О
о
Ш2 (СН2)4
_гпн2/ре н» н^-С^^О
-С7н8 | |
О=С-О
КА
О II
Н1Ч-С-О-СН2
(СН2)4 Ш(СОСНШ)и— Н
ч /
(Сн2)4 НК-СН-С=О
I I
ОС-О
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I
О=С-
О
О II
Н1Ч-С-О-СН2
(СН2)4 Ш(СОСНШ)и— Н
(СН2)4 Н2^— СН— СО-№1
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I О=С-О
(КА - К-карбоксиангидрид).
Как следует из схемы, аминогруппа К-карбок-сиангидрида ¿-лизина, освободившаяся в ходе каталитического удаления №-карбобензоксизащит-ной группы, сразу же выступает в роли инициатора полимеризации К-карбоксиангидрида, что вызывает рост олигомерной (полимерной) цепочки. В процессе дальнейшего каталитического гидрирования продолжается удаление карбобен-зоксизащитных групп как с №-аминогрупп К-карбоксиангидрида лизина (это ведет к появлению новых инициирующих центров полимеризации К-карбоксиангидрида), так и с №-аминогрупп образовавшихся олигомерных (полимерных) цепочек (при полимеризации на них новых порций К-карбоксиангидрида происходит ветвление полимера). Возможна также реакция дополнительного "ветвления" растущего полимера за счет полимеризации К-карбоксиангидридного цикла, находящегося на карбоксильном конце растущей олиго-£-лизиновой (полилизиновой) цепи. Присутствующий в реакционной среде активированный пентафторфениловый эфир Ка-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-бензилоксиметил)гистиди-на по достижении определенной длины полимер-
ных цепочек и с учетом изменившегося начального соотношения К-карбоксиангидрида лизина и активированного эфира гистидина начинает конкурировать с К-карбоксиангидридом №-карбо-бензоксилизина и модифицирует аминогруппы К-концевых остатков лизина растущих полимерных цепей, прекращая рост полимерных цепей.
Чтобы определить возможность регулирования молекулярных масс и размеров гиперраз-ветвленных полилизинов, мы проводили синтез гиперразветвленных полилизинов при массовом соотношении К-карбоксиангидрид №-карбо-бензоксилизина и пентафторфениловый эфир Ка-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-Вот)гистиди-на, равном 1 : 1 и 10:1 соответственно (табл. 1, полимеры 1 и 2). Это отвечает мольному соотношению К-карбоксиангидрид лизин : активированный эфир гистидина 1.8 : 1 для первого полимера и 17 : 1 для второго. По данным аминокислотного анализа образовавшихся полимеров, реальное соотношение лизина и гистидина составило 5.6 : 1 и 75.3 : 1 соответственно (табл. 1).
Количественное определение К-концевых аминокислотных остатков в полученных гипер-
AU 0.015
0.010
0.005
(а)
0.004
0.002
(б)
0.010
0.005
(в)
3 6 9
Время, мин
Рис. 1. Электрофореграммы: а - стандартная смесь Na- и ^-моно-БМР-лизина (1), Na-, №-ди-DNP-лизина (2), Na-, NIm-ди-DNP-гистидина (3);
• - гидролизат DNP-производного полимера 1 (табл. 1): 1 - Na-, Ne-ди-DNP-лизин (4.75 х х 10-9 моль/мл), 2 - Na-, NIm-ди-DNP-гистидин (1.62 х 10-7 моль/мл), мольное соотношение концевых аминокислот лизин : гистидин равно 1 : 34; в - гидролизат DNP-производного полимера 2 (табл. 1): 1 - Na-, №-ди^№-лизин (5.35 х х 10-9 моль/мл), 2 - Na-, ^т-ди^№-гистидин (7.66 х 10-8 моль/мл): мольное соотношение концевых аминокислот лизин : гистидин составило 1 : 14. Экспериментальные условия: кварцевый капилляр с общей длиной 45 см (длина до детектора 38 см) и внутренним диаметром 75 мкм, 5 мМ фосфатный буфер (рН 7.1), напряженность поля 330 В/см, детектирование при 360 нм. AU - absorbance units.
разветвленных полилизинах, выполненное с использованием метода капиллярного электрофореза [21, 22], позволило оценить долю гистидина, связанного с концевыми аминогруппами лизина гиперразветвленного полилизина, и проследить, как изменение их соотношения влияет на строение полимеров (рис. 1). Оказалось, что при переходе от соотношения реагентов К-карбоксиан-гидрид лизина : активированный эфир гистидина, равного 10 : 1, к соотношению 1 : 1 (табл. 1, полимеры 2 и 1) мольное соотношение К-концевых ги-стидиновых
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.