ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 1, с. 85-89
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.115.3:612.115.064
ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИЕ И ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛЕЙЦИНСОДЕРЖАЩИХ ГЛИПРОЛИНОВ
В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА in vitro © 2015 г. А. А. Шабалина*, Л. А. Ляпина**, Д. Л. Рочев**, М. В. Костырева*,
М. М. Танашян*, |З. А. Суслина*
*Научный центр неврологии РАМН, 125367Москва, Волоколамское ш., 80 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т,119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 E-mail: lyapinal@ mail.ru Поступила в редакцию 19.05.2014 г .
Исследованы гиполипидемические, фибринолитические и антикоагулянтные эффекты лейцинсо-держащих глипролинов Pro—Gly—Pro—Leu и Leu—Pro—Gly—Pro in vitro в крови пациентов с нарушением жирового обмена. Установлены гиполипидимическое воздействие глипролинов и их способность снижать полимеризацию и повышать деполимеризацию фибрина в крови человека. Предложены возможные механизмы липолитического действия пептидов через модуляцию липидзависимой фосфолипазы А2.
DOI: 10.7868/S0002332915010129
Проблема борьбы с гиперлипидемией в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость в связи с тем, что увеличивается число больных с повышенным уровнем холестерина в крови. В исследовании INTERHEART было отмечено, что 45% сердечно-сосудистых заболеваний с тромбозами у жителей Западной Европы были связаны с различными проявлениями ги-перлипидемий. Нарушения липидного обмена — основного биологического компонента развития атеросклероза —часто сопровождаются прокоагу-лянтной активацией гемостаза и являются одним из важных факторов риска атеротромбоза и других сосудистых патологий (Luc et al., 2002; Суслина и др., 2005).
В качестве главной терапии при гиперхолесте-ринемии обычно назначают статины в связи с их наибольшей эффективностью. Однако определенные виды статинов могут вызывать побочные эффекты, варьирующие в зависимости от вида препарата, дозы и уровня иммунитета пациента. Поэтому одна из важных задач физиологии и медицины — разработка новых нетоксичных препаратов, способных положительно влиять как на систему гемостаза, так и на липидный обмен. К таким средствам могут относиться эндогенные регуляторы организма или соединения, являющиеся близкими их аналогами. В первую очередь внимание специалистов привлекают регулятор-ные пептиды, в частности лейцинсодержащие глипролины, воздействующие практически на
все физиологические функции организма (Lyapi-na et al, 2008).
Получены данные (Cojocaru et al., 2012), свидетельствующие о том, что валин и лейцин увеличивают содержание холестерина липопротеидов высокой плотности (хсЛПВП), снижают риск развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, особенно при гиперхолестеринемии и атеросклерозе. Считается, что добавление этих аминокислот в пищу предотвращает развитие гиперлипи-демических состояний.
Ряд авторов (Оберган и др., 2013; Andreeva et al., 2013) установили, что многократное интра-назальное введение глипролинов Pro—Gly—Pro (PGP) и Pro—Gly—Pro—Leu (PGPL) крысам со стойкой гиперхолестеринемией и повышенной свертываемостью крови приводило к одновременному восстановлению нарушенных функции противосвертывающей системы и нормализации содержания холестерина в крови.
В экспериментах in vivo после однократного внутривенного введения животным комплексных соединений гепарина с пептидами Pro—Gly, PGP, тафцином, семаксом (в дозах 1 мг/кг) и их составных частей в эквивалентных дозах установлено достоверное повышение антикоагулянтного и фибринолитического потенциала плазмы крови крыс (Lyapina et al., 2008).
Цель работы — изучить влияние двух лейцин-содержащих пептидов Leu—Pro—Gly—Pro (LPGP) и PGPL in vitro на параметры жирового обмена и
Таблица 1. Концентрация, ммоль/л, общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеидов высокой плотности (хсЛПВП) и липопротеидов низкой и очень низкой плотности (хсЛПНП + ЛПОНП) в плазме крови людей после добавления пептидов
Группа ОХ ТГ хсЛПВП хс(ЛПНП + ЛПОНП)
n = 69 24 18 18
NaCl (контроль) PGPL (опыт 1) LPGP (опыт 2) 7.44 ± 0.09 6.64 ± 0.1* (89.2%) 6.59 ± 0.11* (88.5%) 2.17 ± 0.14 1.97 ± 0.12* (90%) 1.86 ± 0.11* (85%) 1.17 ± 0.12 1.40 ± 0.11* (120%) 1.37 ± 0.09* (117%) 6.27 ± 0.11 5.24 ± 0.13* (83.7%) 5.22 ± 0.12* (83%)
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля, принятого за 100%. п — число проб.
*р < 0.05; для табл. 1 и 3.
полимеризацию фибрина в крови пациентов с ги-перлипидемией.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали PGPL и LPGP, синтезированные в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН, а также сыворотку и плазму крови пациентов с гиперхолестеринемией, не получавших терапию статинами. Концентрация общего холестерина (ОХ) варьировала от 6 до 10.6 ммоль/л (в среднем она составила 8.2 ± 1.49 ммоль/л). Для исследования влияния пептидов in vitro к плазме (или сыворотке) крови добавляли пептиды в концентрации 10-3 М и инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Для выяснения возможных механизмов действия пептидов на липидный обмен изучали их влияние на липидзависимую фосфолипазу А2 (LpPLA2) — провоспалительный фермент, связанный с различными липопротеинами. Процессы поли- и деполимеризации фибрина, липид-ный профиль, тромбиновое время, фибриноли-тическую активность (Ляпина и др., 2012), а также количество LpPLA2 измеряли до и после добавления пептидов in vitro в плазме (сыворотке) одного и того же человека.
Измерение суммарной фибринолитической (СФА) и неферментативной фибринолитической (НФА) активности на нестабилизированных пластинах фибрина проводили по стандартной методике (Kudrjashov, Lyapina, 1986). Измерение ли-пидного профиля (триглицеридов (ТГ), ОХ, холестерина липопротеидов низкой и очень низкой плотности (хсЛПНП + ЛПОНП), холестерина липопротеидов высокой плотности (хсЛПВП)) проводили по стандартным методикам на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30 (Konelab, Финляндия) с применением реагентов
фирмы "Randox" (Великобритания), а также на диагностических наборах фирмы "Ольвекс-диа-гностикум" (Россия).
Измерение образования и растворения фибри-нового сгустка проводили спектрофотометриче-ски с помощью полимеризации и деполимеризации фибрина на основе турбидиметрического анализа, предложенного Щербак с соавт. (2001), в нашей модификации, заключающейся в ускорении процесса растворения фибринового сгустка и предотвращении стабилизации фибрина путем добавления монохлоруксусной кислоты (МХУ). Полимеризацию фибрина (ПМФ) рассчитывали как скорость увеличения, а деполимеризацию фибрина (ДПМФ) — как скорость снижения оптической плотности под действием тромбина. Для определения свертывающей способности крови использовали диагностический набор АЧТВ-тест и Тромботест (Технология-Стандарт, Россия). В работе применяли фибриноген и тромбин — коммерческие препараты Каунасского предприятия бактериальных препаратов (Литва).
Количество LpPLA2 измеряли с использованием иммуноферментного анализа (ИФА)-риде-ра Victor 2 (США) на реагентах фирмы "Uscn" (США, Китай). Тест-системы основаны на количественном ИФА прямого "сандвичевого" типа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании влияния PGPL и LPGP на липидный профиль было выявлено достоверное увеличение содержания хсЛПВП на 17—20% и снижение концентрации ОХ на 11—11.5% за счет уменьшения показателей ТГ (на 10—15%) и хсЛПНП + ЛПОНП (на 16.3-17%) в крови пациентов с гиперхолестеринемией (табл. 1).
Было также выявлено повышение фибриноли-тической активности крови по результатам уве-
ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИЕ И ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ 87
Таблица 2. Влияние РОРЬ и ЬРОР на параметры гемостаза в крови человека с гиперхолестеринемией (М ± т)
Группа ТВ, с СФА, 2 мм2 НФ, 2 мм2 ФФ, мм2 ПМФ (скорость, усл. ед./с) ДПМФ (скорость, усл. ед./с) ПМФ (плотность, усл. ед.) ДПМФ (плотность, усл. ед.)
№С1 (контроль) 14.1 ± 1.4 23.1 ± 2.3 12.3 ± 2.6 10.8 ± 1.1 (2.4 ± 0.3) х х 10-3 (6.2 ± 1.5) х х 10-4 0.68 ± 0.11 0.064 ± 0.01
РОРЬ (опыт 1) 16.3 ± 1.7 45.8 ± 4.5** 29.6 ± 3.2** 16.1± 2.6* (1.8 ± 0.2) х х 10-3 (1.28 ± 0.1) х х 10-3** 0.44 ± 0.07 0.12 ± 0.02*
ЬРОР (опыт 2) 18.5 ± 1.9 47.8 ± 4.5** 29.2 ± 2.9** 17.2 ± 3.5* (1.7 ± 0.2) х х 10-3 (1.6 ± 0.1) х х 10-3** 0.42 ± 0.05 0.15 ± 0.03*
Примечание. ТВ — тромбиновое время, СФА — суммарная фибринолитическая активность, НФ — неферментативный фиб-ринолиз, ФФ — ферментативный фибринолиз, ПМФ — полимеризация фибрина, ДПМФ — деполимеризация фибрина. **р < 0.01.
Таблица 3. Содержание липидзависимой фосфолипазы А2 (ЬрРЬА2) в сыворотке крови человека после инкубации с ЬРОР и с РОРЬ, нг/мл
Группа Исходное содержание ЬрРЬА2 ЬрРЬА2 после инкубации с ЬРОР ЬрРЬА2 после инкубации с РОРЬ
1 2.65 ± 0.09 3.08 ± 0.12* 3.48 ± 0.14*
2 3.3 ± 0.07 3.21 ± 0.21 3.5 ± 0.1
3 6.05 ± 0.11 5.3 ± 0.08 3.9 ± 0.1*
Примечание. Группы 1—3 — пациенты с исходно нормальным, с незначительно повышенным, с исходно высоким содержанием ЬрРЬА2 соответственно.
личения СФА в 1.9—2.1 раза и НФА более чем в 2 раза. Антикоагулянтная активность по данным теста тромбинового времени увеличивалась в 1.1—1.3 раза (табл. 2). Исследуемые пептиды уменьшали как скорость полимеризации фибрина под действием тромбина на 25—28%, так и плотность образующихся сгустков на 35—38%. ДПМФ, индуцированная МХУ, под действием РОРЬ и ЬРОР ускорилась в 2.1 и в 2.6 раза соответственно, а плотность фибриновых сгустков снизилась в 1.9 и 2.3 раза соответственно (табл. 2). При этом ЬРОР действовал на скорость деполимеризации фибрина наиболее эффективно. Для оценки влияния пептидов на ЬрРЬА2 пациенты были разделены на три группы, различающиеся содержанием ЬрРЬА2 (табл. 3).
Было выявлено, что после инкубации с пептидом РОЬР у пациентов группы 1 концентрация ЬрРЬА2 увеличивалась на 0.43 нг/мл (для ЬРОР)
или на 0.83 нг/мл (для РОРЬ), у пациентов группы 2 она не изменялась, а у пациентов группы 3 значительно снижалась (на 0.7 нг/мл для ЬРОР или на 2.1 нг/мл для РОРЬ), т.е. достигала практически одинаковых значений во всех групп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.