научная статья по теме Гликозидазы человека в системе обращенных мицелл ПАВ: особенности свойств и кинетические закономерности катализа Химия

Текст научной статьи на тему «Гликозидазы человека в системе обращенных мицелл ПАВ: особенности свойств и кинетические закономерности катализа»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Том 19 * № 2 * 1993

УДК 577.152.321.04

© 1993 г. А. В. Пшежецкий, Е. М. Бейер *, О. А. Бунеева *, М. В. Виноградова, А. В. Левашов **, Г. Я. Видершайн *

ГЛИКОЗИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ПАВ: ОСОБЕННОСТИ СВОЙСТВ И КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА

НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ;

Институт биологической и медицинской химии РАМН, Москва;

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет

Кинетические закономерности катализа лизосомными гликозидазами реакций гидролиза их синтетических субстратов исследованы в системах обращенных мицелл анионного ПАВ — аэрозоля ОТ — в октане. Установлено, что все исследованные ферменты (Ом,-галактозидаза, гексозаминидазы А и 3, сиалидаза, фукозидаза, галакт^цереброзидаза) проявляют в системе обращенных мицелл каталитическую активность, равную йли большую их. активности в водных буферных растворах. В то же ¡зремя в обращенных мицеллах наблюдается эффективное ингибирование ферментов продуктами реакции — углеводами. Обнаружено, что зависимости удельной активности гликозидаз от степени гидратации мицелл представляют собой кривые с одним или несколькими максимумами, отражающими образование различных олигомерных форм ферментов. Установлено, что зависимость от степени гидратации эффективного значения Кт катализируемых реакций, определенного в расчете на объем водной микрофазы системы, как правило, повторяет ход зависимости от того же параметра максимальной скорости реакции, что, по-видимому, объясняется соответствующим изменением локальных значений концентрации субстрата в области активного центра фермента. Исследовано влияние концентрации ПАВ на каталитическую активность фермента в системе обращенных мицелл. Установлено, что каталитическая активность гликозидаз, распределенных в цитозольной фракции при дифференциальном центрифугировании клеточного материала, не зависит от концентрации мицелл. Каталитическая активность мембранной гликозидазы — галактоцереброзидазы — существенно возрастает по мере уменьшения концентрации мицелл в системе. В оптимальных условиях активность галактоцереброзидазы в обращенных мицеллах в 10 раз превышает уровень активности фермента в водных буферных растворах.

О-Гликозидазы (КФ 3.2.1) составляют большую группу гидролитических ферментов, катализирующих расщепление углеводов и углеводсодержащих биополимеров (гликоконъюгатов). Наследственная недостаточность активности той или иной лизосомной гликозидазы или белковых факторов, необходимых для нормального функционирования этих ферментов, приводит к возникновению у человека ряда тяжелых наследственных болезней — так называемых лизосомных болезней накопления [1—3]. В силу этого исследование организации, механизмов функционирования и регуляции гликозидаз является исключительно актуальной задачей.

Большинство гликозидаз в клетке функционирует в лизосомном матриксе, который по своим физико-химическим свойствам существенно отличается от водной среды [4]. Величина рН внутри лизосом колеблется обычно в пределах

Сокращения: ПАВ — поверхностно-активное вещество; аэрозоль ОТ (АОТ) — натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты; МОТ — 4-метилумбеллиферон; НКМи? — б-гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферон.

11.0

£

гГ

V h \

0,5

\

\

\

\

\

\ о \

J_

LL

MUH

Рис. 1. Кривые накопления 4-метилумбеллифе-рона в реакции гидролиза GalMuf, катализируемой GMi-галактозидазой в составе галактосиа-лидазного комплекса в системе обращенных мицелл АОТ со степенью гидратации 30 (/), 38 (2), а также в водном буферном растворе (3). Конечные концентрации реагентов в инкубационной смеси: 100 мМ ацетат-фосфат-цитратный буфер, pH 3,0—4,75, субстрат — 50 мкМ, фермент — 40 мкг/мл (в водной фазе), 0,1 М АОТ в октане. Температура 37° С

3 Ч 5

[6аЬ],МкМ

Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза Са1МиГ, катализируемой См1-галак-тозидазой в составе галактосиалидазного комплекса в системе обращенных мицелл АОТ со степенью гидратации 38, от концентрации в системе О-галактозы. Светлые кружки — экспериментальные данные, штриховая линия — теоретическая зависимость, рассчитанная на основании кинетической кривой гидролиза Са1Мг^ (рис. 1, кривая 2). Условия эксперимента см. в подписи к рис. 1

4,5—5,0, что значительно ниже рН в цитоплазме клетки [5]. Наконец, согласно последним данным [6—10 ], гликозцдазы могут образовывать в лизосоме белок-белковые и белок -ли пидные ансамбли, каталитические свойства которых также во многом отличаются от свойств индивидуальных ферментов. В силу перечисленных обстоятельств изучение выделенных и очищенных гликозидаз в водных буферных растворах далеко не всеща дает адекватное представление об их функционировании in vivo.

Для моделирования в экспериментах in vitro различных параметров микроокружения ферментов в клетке в последние годы разработан ряд экспериментальных подходов. В частности, в качестве одной из модельных систем в настоящее время широко используются гидратированные обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в неполярных органических растворителях [II—15]. Использование систем обращенных мицелл ПАВ позволяет моделировать рад факторов, характерных для микроокружения гликозидаз в лизосомах клетки: микрокомпартментализацию системы, наличие контакта с липидной матрицей, характерные значения рН и ионной силы среды. Благодаря использованию данного подхода нам удалось выявить ряд новых свойств гликозидаз, а именно: установить существование комплекса между гексозаминидазами А и Б [16—17], исследовать влияние лизосомной карбоксипептидазы (протекторного белка) на прочность ассоциации Gmi-галактозидазы и сиалидазы в мультиферментном галактосиали-дазном комплексе [18], показать, что гликолипиды могут влиять на каталитическую активность и олигомерную структуру a-L-фукозидазы [19].

Настоящая работа посвящена исследованию кинетических закономерностей катализа лизосомными гликозидазами в системах обращенных мицелл ПАВ.

Гидролиз 4-метилумбеллиферилгликопиранозидов в системах обращенных мицелл

На рис. 1 приведены кинетические кривые реакций гидролиза Са1Ми?, катализируемого См1-галактозидазой (КФ 3.2.1.23) в системе обращенных мицелл АОТ в октане при различных степенях гидратации (Жо — молярные отношения

[Н20]/[А0Т]) (кривые 1 и 2) и в водном буферном растворе (кривая 3). Видно, что, хотя начальная скорость образования продукта — 4-метилумбеллиферона — в системах обращенных мицелл может быть существенно выше, чем в водном буферном растворе (ср. кривые 2 и 3), в течение 10—15 мин в мицеллярных системах происходит снижение скорости образования продукта практически до нуля. Степень гидролиза субстрата в мицеллярных системах, как правило, не превышает 10%. Аналогичный вид зависимостей накопления продукта от времени характерен и для других исследованных гликозидаз: гексозаминидаз А и Б (КФ 3.2.1.30), сиалидазы (КФ 3.2.1.18), фукозидазы (КФ 3.2.1.51), галактоцеребро-зидазы (КФ 3.2.1.46). Подобный характер кинетики накопления продукта может быть в принципе объяснен рядом факторов, и в том числе быстрой инактивацией фермента в обращенных мицеллах или ингибированием фермента продуктами реакции.

Для проверки предположения об инактивации фермента нами были проведены эксперименты по инкубированию фермента в системе обращенных мицелл при различных значениях степени гидратации (м>) в течение 30, 60 и 180 мин. После инкубирования реакцию инициировали внесением микролитровых количеств раствора субстрата. Во всех случаях кривые накопления продукта были идентичны полученным в том случае, когда реакцию инициировали внесением в систему фермента (рис. 1). На основании этих данных предположение об инактивации гликозидаз в системе обращенных мицелл было нами отвергнуто.

Известно, что моносахариды могут являться ингибиторами соответствующих гликозидаз. В системе обращенных мицелл в силу эффекта микроконцентрирования образующихся в результате реакции Сахаров в полярной внутренней полости обращенных мицелл эффект ингибирования может быть усилен. Для проверки этого предположения были определены начальные скорости гидролиза Са1М1^ в системах обращенных мицелл в присутствии различных концентраций продукта реакции — ¿-галактозы (рис. 3). В присутствии микромолярных концентраций галактозы в системах обращенных мицелл наблюдается существенное ингибировйние См1-галактозидазы, причем экспериментально определенные значения начальной скорости реакции хорошо описываются теоретической кривой, рассчитанной на основании кривой 2 (рис. 1). С другой стороны, после практически полной остановки процесса гидролиза субстрата (40 мин инкубации) реакция может быть снова инициирована разбавлением системы раствором субстратсо-держащих обращенных мицелл с той же степенью гидратации. Полученные данные позволяют заключить, что в обращенных мицеллах происходит эффективное ингибирование гликозидаз углеводными продуктами реакции.

Зависимость каталитической активности гликозидаз в системах обращенных мицелл от степени гидратации.

На рис. 3 приведены зависимости удельной каталитической активности гликозидаз в системе обращенных мицелл от степени гидратации — параметра, определяющего размеры обращенных мицелл в системе. Как видно, для всех ферментов эти зависимости имеют вид кривых с одним или несколькими максимумами. Именно такой вид зависимости активности от ню характерен для большинства ферментов, исследованных в системах обращенных мицелл [15, 20 ]. При этом максимальная каталитическая активность фермента, как правило, проявляется в том случае, когда фермент включен в мицеллу, размеры внутренней водной полости которой совпадают с размерами глобулы фермента [15, 20]. Обнаруженная закономерность выполняется и в случае гликозидаз. Как видно из рис. 4, молекулярные массы гликозидаз, определенные нами на основании данных БОБ-электрофореза или гель-фильтрации, хорошо коррелируют с теоретически рассчитанными [15, 20 ] молекулярными массами белков, радиусы которых

Рис. 3. Зависимость удельной активности Ом1-галактозидазы (Л и сиал

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком