УДК 577.35
ГЛУБИНА КАРМАНА В БЕЛКОВОЙ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИОРОДОПСИНА ВБЛИЗИ ПЕРЕНОСЧИКА ПРОТОНА Asp96 СОГЛАСНО РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫМ МОДЕЛЯМ
© 2011 г. Л. В. Хитрина
Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы; факс: (495)9393181; электронная почта: khitr@phtbio.genebee.msu.su Поступила в редакцию 17.03.2010 г.
После доработки 21.07.2010 г.
Трехмерные рентгеноструктурные модели бактериородопсина дикого типа исследованы с помощью программы РуМОЬ. При построении поверхностей, доступных растворителю с цитоплазматиче-ской стороны, визуализирована полость напротив Азр96, сокращающая путь протона от поверхности мембраны к этому переносчику. Расстояние от полости до центра углеродного атома упомянутой карбоксильной группы ~6 А. Также для структур ЦЩ и 1ВКЯ выявлен канал радиусом 1.1 А между цитоплазматической поверхностью и карбоксилом Азр96. Диаметр этого канала меньше характерного диаметра молекулы воды и в обычных условиях не создает проводимости невозбужденного светом пигмента, но по нему, вероятно, и открывается обводненная "щель" во второй фазе фотоцикла бактериородопсина, связанная с репротонированием Азр96.
Ключевые слова: бактериородопсин, доступная растворителю поверхность, перенос протона, трехмерная структура белка, РуМОЬ.
Бактериородопсин — протонный насос, использующий энергию света [1]. Его хромофор — основание Шиффа б-аминогруппы Ьуз216 и рети-наля [2]. Транспортная функция связана с фотоциклом. При образовании центрального интер-медиата протон уходит с основания Шиффа в сторону наружной поверхности мембраны, а затем другой протон поглощается с цитоплазмати-ческой стороны. Таким образом, за один оборот цикла интегрально переносится один протон. При этом азот основания Шиффа находится на расстоянии 22 А от цитоплазматической поверхности мембраны, и установлена единственная группа, которая депротонируется и протонирует-ся в ходе этого переноса — карбоксил Азр96. Расстояние между этими азотом и углеродом карбоксила — 12 А, причем переносчики находятся практически на нормали к поверхности мембраны (расчет по структуре 1c3w [3]). Для переноса Н+-иона в ходе фотоцикла ряд гипотез рассматривает образование цепочек водородных связей [2], а гипотеза В.П. Скулачева [4—6] — раскрытие обводненной щели. Последний вариант группе А.Д. Каулена казался более убедительным и лег в основу схемы механизма функционирования бактериородопсина [3, 7—9]. Данная работа посвящена исследованию структур бактериородоп-сина для детализации пути переноса протона на основание Шиффа.
Поиск каналов в молекуле бактериородопсина актуален с момента его открытия, с 1971 года [1]. Их постулируют и постепенно изучают уже почти 40 лет. Расстояния, которые должен преодолеть протон на каждом из этапов переноса, неоднократно обсуждались, однако пока никто не представил визуализацию кармана с цитоплазматической стороны молекулы, доступного воде, и не получил расстояния от него до ближайшего переносчика.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализ файлов трехмерных белковых структур из базы данных RCSB проведен в программе PyMOL (большая часть настроек программы использована по умолчанию). Для детального исследования выбраны структуры бактериородоп-сина дикого типа "in steady-state", т.е. в не возбужденном светом состоянии.
Программа PyMOL позволяет рассчитать и визуализировать поверхность, доступную растворителю с заданным радиусом (за критерий доступности принята стерическая возможность шарика соответствующего размера прикоснуться к расчетной границе). Для счета использован параметр поверхности "surface_quality, 2". При этом на рис.1 для изображения поверхности в виде сетки ("set surface_type, 2") выбраны команды "set
Рис. 1. Неровности цитоплазматической поверхности бактериородопсиновых структур (а, б — 1БКК, показан один мономер; в, г — Шариками изображены ван-дер-ваальсовы сферы: светло-серым — азотов лизина (N40, N41 —
свободных аминогрупп соответствующих остатков, которые, как было выяснено ранее [3, 10], могут служить ориентирами места расположения поверхности мембраны; у 1у$216 — в составе основания Шиффа), темно-серым и черным — углерода и кислорода протонпереносящего карбоксила ЛБр96. Крестиками показаны центры молекул прочно связанной воды. Сеткой изображена часть наружной поверхности, доступной растворителю: а, в — радиус растворителя 1.4 А, что соответствует молекуле воды; б и г — радиус 1.1 А.
surface_quality, 1" и "set mesh_width, 0.5" с контрастированием двумя источниками света, что в масштабе рисунка способствует разумному размеру ячеек и их четкости.
Для передачи градациями серого вкладов аминокислотных остатков в касающуюся их поверх-
ность (рис.2) выбран обычный тип поверхности ("set surface_type, 0") с двухсторонним окрашиванием ("set two_sided_lighting, on"), но без определения ее цветности командой "color" и без дополнительной подсветки ("set light_count, 0"). Так как оттенки серого на рисунках, выполненных
Рис. 2. Детализация поверхности узкого канала (часть поверхности, доступной растворителю радиусом 1.1 А, согласно программе PyMOL, общий вид в составе молекулы см. рис. 1). Вклады разных аминокислотных остатков выделены оттенками: 1 — Asp38, 2 — Lys41, 3 — Phe 42, 4 — Ile 45, 5 — Leu95, 6 — Asp96, 7 — Leu 99. Показаны также ван-дер-ваальсовы сферы свободного азота Lys41 и карбоксила Asp96. Первый ряд — визуализация для структуры 1BRR, второй — для 1c3w, третий — для 1qhj. Исследованные модели опубликованы разными коллективами: 1c3w (группа Лани [11]) и 1qhj (французская лаборатория [19]) — мономеры, кристаллы (гексагональные пластинки) выращены в кубической липид-ной фазе; 1BRR (группа Остерхельта [12]) — тример, кристаллы гетерогенные моноклинные, получены по оригинальной методике немецких исследователей без добавления чужеродных липидов.
программой PyMOL, определяются не только заданием цвета в явном виде, но и перспективой, для минимизации последней использована орто-скопическая проекция ("set orthoscopic, on"). Остатки красили в основные цвета (красный, желтый, зеленый, циан, синий, мажента, черный), а преобразование в серый происходило в подпрограмме Corel PHOTO-PAINT пакета CorelDRAW после коррекции оттенков, насыщения и яркости, а также уменьшения контраста изображения в пределах одного цвета с помощью "кривой тонов".
Окончательная "сборка" рисунков выполнена в программе CorelDRAW.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 визуализированы элементы структуры бактериородопсина для моделей 1c3w и 1BRR. Показана часть протонпереносящего пути, начинающегося со стороны цитоплазматической поверхности мембраны: "ножка" остатка Asp96 с выделенным карбоксилом и хромофор с выделенным атомом азота. Атомы азота свободных аминогрупп остатков лизина № 40 и 41, локализованные вблизи полярных голов липидов пурпурной мембраны [3, 10], служат "маркерами" усредненной поверхности мембраны. Вычислена поверхность, доступная растворителю с заданным радиусом, окружающая молекулу. В виде сетки показана только часть этой поверхности, важная для дальнейшего обсуждения, в том числе огибающая поверхностный атом азота Lys41. Анализ разных рентгеноструктурных моделей бактерио-родопсина позволил найти углубление на цито-плазматической поверхности полипептидных цепей вблизи Asp96, размеры которого позволяют входить в него воде (рис. 1а, в). Следовательно, реальное расстояние протонпереносящей карбоксильной группы Asp96 до обводненной области меньше, чем до усредненного уровня поверхности мембраны, как предполагалось ранее [7, 8]. Так, в структуре 1BRR центр углеродного атома свободной карбоксильной группы Asp96 находится в 5.76 Â от наружной полости, а в структуре 1c3w — в 6. 11 Â. Совпадение блестящее, учитывая кристаллографическое разрешение
(1c3w [11] - 1.55 Â, 1BRR [12] - 2.9Â)1, а также различие методов кристаллизации и типов кристаллов (1BRR — гетерогенные моноклинные кристаллы тримеров бактериородопсина, полученные без добавления чужеродных липидов по собственной оригинальной методике группой Остерхельта [12]; 1c3w — кристаллы из молекул мономеров в виде гексагональных пластинок,
1 Кристаллографическое разрешение в 1.55 Â соответствует точности координат атомов 0.3—0.5 Â, а разрешение в 2.9 Â — точности 0.5—1 Â.
выращенных в кубической липидной фазе в группе Лани [11]). Значит, толщина слоя белковой структуры между цитоплазматическим краем молекулы бактериородопсина и Asp96 только ~6 Â, а не 12 Â [13] или 10 Â [3], как предполагалось ранее. Для дальнейших исследований и построения принципиальной схемы работы протонного насоса это важное уточнение, в частности, важный момент для математического анализа быстрой кинетики электрического сигнала (по напряжению) при однократном обороте фотоцикла, индуцированном лазерной вспышкой света. Значит, отвлекаясь от деталей, надо искать не две примерно равные по амплитуде компоненты (где одна отражает движение протона между цитоплазма-тической поверхностью и Asp96, а другая — между Asp96 и основанием Шиффа), а компоненты с заметно неравными амплитудами. Одна из непреодоленных проблем связана со сложностью разделения миллисекундной фазы электрического ответа на компоненты, соответствующие разным интермедиатам фотоцикла, и привязки этих компонент к участкам переноса в белковой структуре [8]. Имеется в виду прямой метод измерения быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов на плоской искусственной мембране с ассоциированными бактериородоп-синсодержащими пузырьками [14]. Близость времен упомянутых компонент электрогенеза и принципиальная неоднозначность экспоненциального анализа [8, 15] делает предсказания в части амплитуд искомых компонент весьма полезными.
По-видимому, наличие водного кармана — один из общих принципов работы транспортных белков, так как выемки в зоне переноса найдены и у некоторых других белков-переносчиков [16 -18].
Более неожиданным оказалось следующее: формальное уменьшение радиуса растворителя при построении поверхности в программе PyMOL привело к углублению "впа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.