ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2011, № 4, с. 456-462
= ЭКОЛОГИЯ =
УДК 628.394(26)+577.15(265.54)
ГЛУТАТИОН^-ТРАНСФЕРАЗА КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЙ БИОМАРКЕР СОСТОЯНИЯ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ АНТРОПОГЕННОМ
ВОЗДЕЙСТВИИ © 2011 г. О. Н. Лукьянова, С. А. Ирейкина
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (ТИНРО-Центр), 690950 Владивосток, пер. Шевченко, 4 E-mail: onlukyanova@tinro.ru Поступила в редакцию 25.08.2010 г.
Исследована активность ключевого фермента II фазы биотрансформации органических электро-фильных соединений глутатион-8-трансферазы (rST) у двустворчатого моллюска мидии Грея Crenomytilus grayanus, ракообразного мизиды удивительной Neomysis mirabilis и полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata из залива Петра Великого Японского моря. Активность фермента была повышена у рыб и моллюсков из загрязненных районов по сравнению с фоновыми. У мизид загрязнение вызывало ингибирование активности фермента. Рассмотрена роль TST в процессах адаптации разных видов к имеющемуся уровню загрязнения.
Глутатион^-трансфераза (TST) относится к ключевым ферментам II фазы биотрансформации органических поллютантов и некоторых эндогенных соединений. Фермент катализирует конъюгацию трипептида глутатиона с электро-фильными субстратами, к которым среди ксенобиотиков в первую очередь относятся полициклические ароматические углеводороды и поли-хлорированные бифенилы, а среди эндогенных метаболитов — половые стероидные гормоны, простагландины, жирные кислоты и их производные (Колесниченко, Кулинский, 1989).
Для оценки состояния организмов в условиях загрязнения в современных программах мониторинга используют различные молекулярные биомаркеры — биохимические показатели, которые позволяют судить как о присутствии токсиканта, так и об ответной реакции организма на внешнее воздействие (Лукьянова, 2001). TST, наряду с ме-таллотионеинами и цитохромом P450, относится к биомаркерам защитной реакции, развивающейся в организме при воздействии различных загрязняющих веществ, в отличие, например, от пе-рекисного окисления липидов или разрывов в цепи ДНК, которые являются биомаркерами повреждения (De Lafontaine et al, 2000).
TST обнаружена у представителей различных групп организмов, в том числе у растений, микроорганизмов, беспозвоночных и позвоночных животных, как наземных, так и водных (Wilce, Parker, 1994). Среди морских гидробионтов TST изучена у некоторых видов рыб (Van Veld, Lee, 1988; Donham et al., 2005, 2007; Napierska et al., 2006), моллюсков (Balabaskaran et al., 1986; Hoarau et al., 2004) и ракообразных (Vijayavel et al., 2004; Jemec
et al., 2007). Известны семь основных классов водорастворимых rST и несколько дополнительных, которые не являются видоспецифичными, но катализируют разные типы субстратов (Salinas, Wong, 1999). Наличие широкого набора изофер-ментов в клетках особей, обитающих в загрязненных водах, позволяет им осуществлять детокси-кацию различных органических поллютантов и успешно существовать в неблагоприятных условиях. Цель работы — изучение суммарной активности rST у отдельных представителей рыб, моллюсков и ракообразных, относящихся к региональным индикаторным видам и обитающих в условиях хронического загрязнения в зал. Петра Великого Японского моря.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили особи полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata, мидии Грея Crenomytilus grayanus и мизиды удивительной Neomysis mirabilis, собранные в летний период 2004—2006 гг. в нескольких районах зал. Петра Великого Японского моря с различной степенью загрязнения (рис. 1).
Камбалы (по 12 экз.) были выловлены в заливах второго порядка Амурском и Уссурийском, расположенных в северной части зал. Петра Великого и омывающих п-ов Муравьева-Амурского, на котором находится крупный город-порт Владивосток. Заливы отличаются по степени загрязнения, удельный показатель поступления загрязняющих веществ в Амурский зал. в 50 раз больше по сравнению с Уссурийским (Лукьянова и др., 2007а). В настоящее время все районы оби-
43°20'
43°
131°20'
131°40' 132°
Рис. 1. Карта-схема района работ.
132°20'
тания вида в прибрежной зоне зал. Петра Великого испытывают в той или иной степени антропогенное воздействие, и выбрать фоновый район не представляется возможным. Поэтому мы проводили изучение динамики активности фермента у рыб из скоплений, приуроченных к районам с заведомо разной степенью загрязнения.
Экземпляры мидии Грея (6 экз. на каждой станции) размером 10—12 см были собраны в прибрежных водах о-ва Рейнеке, который расположен на границе Амурского и Уссурийского заливов, вдали от источников загрязнения и рассматривается как условно фоновый район; в бухте Перевозная и у мыса Песчаный, расположенных во внутренней части Амурского зал. и подвергающихся хроническому антропогенному загрязнению. В Уссурийском зал. мидий собирали на двух станциях: бухта Лазурная — место массового летнего отдыха жителей г. Владивостока, и бухта Суходол, локальный удельный показатель поступления загрязняющих веществ в которую один из самых высоких для всего зал. Петра Великого (Огородникова, 2001).
Мизид отлавливали в Уссурийском зал. в бухте Лазурная, а также у о-ва Рейнеке.
Камбал препарировали непосредственно после отлова. Извлекали печень, промывали 0.9%-ным раствором №С1 и доставляли в лабораторию во льду. Мидий доставляли в емкостях с морской водой, после чего на льду препарировали гепато-панкреас и жабры. Мизид исследовали целиком. Рачков с каждой станции объединяли в три параллельные пробы по 15—20 экз. и во льду доставляли в лабораторию. Все анализы проводили в течение суток с момента отбора проб.
Навески образцов массой около 1 г гомогенизировали в 0.05 М трис-НС1 буфере (рН 7.5) в ледяной бане. Полученные гомогенаты центрифугировали при 10000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. Все измерения проводили на спектрофотометре 8Ытаё2и иУ-31008 (Япония). В суперна-тантах измеряли концентрацию белка по методу Гринберга ^геепЪег§, Gaddock, 1982). Активность Г8Т определяли в реакции с субстратом 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) (ИаЫ§ а1., 1974). Реакционная смесь содержала 0.1 М
30
20
S 15
s
10
□ l И 2
(а)
"I"
о-в Рейнеке
бухта Перевозная
60 50 40 30 20 10
мыс Песчанный
(б)
о-в Рейнеке
бухта Суходол
бухта Лазурная
Рис. 2. Активность Г8Т в органах мидии Грея из разных районов Амурского (а) и Уссурийского (б) заливов. 1 — гепа-топанкреас, 2 — жабры.
а25
5
фосфатный буфер (рН 6.5), 1 мМ восстановленный глутатион, 1 мМ ХДНБ и исследуемый гомо-генат. Пробы инкубировали 20 мин при 27°С, затем останавливали реакцию добавлением 1 N раствора HCl и проводили измерение оптической плотности при длине волны 340 нм. Расчет производили с учетом коэффициента молярной экс-тинкции ХДНБ, равного 9.6 мМ-1 • см-1. Активность выражали в нмоль образовавшегося продукта реакции (коньюгата)/(мин • мг белка).
При статистической обработке результатов рассчитывали среднее М и ошибку среднего m. Достоверность различий полученных результатов определяли по i-критерию Стьюдента при уровне значимости 0.95.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
У мидий активность Г8Т была обнаружена во всех исследованных органах. Более высокие зна-
160
ка140
J 120
н
s
100 80
g 60
I 40 20
Июнь
Август
□ 1 ЕЗ 2
Рис. 3. Активность Г8Т в печени полосатой камбалы из Амурского (1) и Уссурийского (2) заливов.
чения характерны для гепатопанкреаса по сравнению с жабрами.
При сравнении животных с разных станций Амурского зал. повышение активности фермента обнаружено у моллюсков из внутренних, более загрязненных районов залива (рис. 2а). Максимальная активность Г8Т отмечена у мидий, собранных в районе мыса Песчаный — 25 нмоль/(мин • мг белка) в гепатопанкреасе и 17 — в жабрах. Для мидий из фонового района у о-ва Рейнеке значения данного показателя достоверно ниже (11 и 5 нмоль/(мин • мг белка) соответственно). Мидии из бухты Перевозная характеризовались средней активностью фермента — 15 нмоль/(мин • мг белка) в гепатопанкреасе и 13 — в жабрах.
Подобная тенденция отмечена и у мидий из Уссурийского зал. В гепатопанкреасе мидий из внутренних, более загрязненных районов залива (бухты Суходол и Лазурная) активность Г8Т составляла в среднем 42 и 58 нмоль/(мин • мг белка) соответственно, что выше в два и три раза по сравнению с мидиями, отобранными у о-ва Рей-неке (рис. 2б). В жабрах мидий из бухты Лазурная активность фермента была на 50%, а у мидий из Суходола на 20% выше таковой у мидий с фоновой станции.
За период исследования отмечено увеличение активности Г8Т в гепатопанкреасе мидий из фонового района (о-в Рейнеке) в два раза. В августе 2004 г. она составляла 11, а в августе 2006 г. — 19 нмоль/(мин • мг белка).
Сходная с мидиями картина наблюдалась у рыб. Активность Г8Т у полосатой камбалы из Амурского зал. в начале лета, в июне, составляла 140 нмоль/(мин • мг белка) и была примерно на 30% выше по сравнению с рыбами из Уссурийского зал. (105 нмоль/(мин • мг белка)) (рис. 3). В августе различия были недостоверны, однако в среднем у рыб из Амурского зал. активность была
на 10% выше. Отмечено снижение абсолютного значения активности фермента от июня к августу.
В отличие от мидий и рыб, у мизид, собранных в загрязненной бухте Лазурной, активность TST (в среднем 49 нмоль/мин • мг белка) была на 15% ниже, чем у рачков из фонового района, о-ва Рей-неке (57.5 нмоль/(мин • мг белка)).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Исследованные морские организмы относятся к типичным обитателям прибрежных мелководий. Именно эти районы испытывают максимальное антропогенное воздействие. Среди загрязняющих веществ, поступающих в Амурский и Уссурийский заливы, выявлены нефтепродукты, пестициды, фенолы, синтетические поверхностно-активные вещества, тяжелые металлы, в том числе свинец, кадмий, хром, никель (Нигма-тулина, 2007). В моллюсках и рыбах из данного района отмечено накопление ДДТ и гексахлор-циклогексана (Лукьянова и др., 2007б). Экспериментально доказано, что ^Т участвует в детокси-кации таких электрофильных соединений, как арохлор, ДДТ, линдан, атразин (Hayes, Pulford, 1996), других фосфор- и хлорорг
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.