УДК 577.152.25*1181
По материалам доклада на VI Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (11-15 VI, 20013)
ГЛУТАТИОН^-ТРАНСФЕРАЗА КЛАССА АЛЬФА ИЗ ПЕЧЕНИ ЩУКИ
© 2013 г. Е. В. Борвинская#, Л. П. Смирнов, Н. Н. Немова
ФГБУНИнститут биологии Карельского научного центра РАН, 185910, Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 Поступила в редакцию 18.02.2013 г. Принята к печати 17.04.2013 г.
Из печени щуки Esox lucius выделена глутатион^-трансфераза (GST), которая очищена до гомогенного состояния согласно критериям подвижности при SDS-электрофорезе и изоэлектрофокусиро-вании. Фермент представляет собой гомодимер с молекулярной массой субъединицы 25235.36 Да (по данным ВЭЖХ-МС/МС) и pI около 6.4. Исследованы первичная структура, субстратная специфичность, термостабильность, зависимость каталитической активности фермента от кислотности среды и концентрации субстрата. Выделенная изоформа GST была идентифицирована как GST класса альфа.
Ключевые слова: глутатион-Б-трансфераза, система биотрансформации ксенобиотиков, окислительный стресс.
DOI: 10.7868/S0132342313050059
ВВЕДЕНИЕ
Глутатион^-трансферазы (GST, КФ 2.5.1.18) являются представителями очень древнего суперсемейства ферментов, появившегося в результате эволюционных преобразований тиоредоксинпо-добного предшественника, как ответной реакции на возникновение аэробных условий в окружающей среде [1, 2]. GST катализируют реакцию общего типа, заключающуюся в конъюгации восстановленного глутатиона (GSH) с молекулами, имеющими электрофильные центры. Эта реакция — одна из важнейших в метаболическом пути деградации множества токсичных соединений, в том числе образующихся в ходе окислительного стресса [3, 4]. Основная масса работ посвящена глутатион^-трансферазам относительно небольшого числа видов млекопитающих, являющихся модельными объектами для биохимических исследований, и человека, для которого было установлено участие GST в этиологии ряда онкологических заболеваний [3, 5—7]. Интерес к изучению GST как обязательных участников процесса биотрансформации ксенобиотиков у рыб возник значительно позднее и был связан с резким ухудше-
Сокращения: СВМБ — 1-хлор-2,4-динитробензол; ОСМВ — 1,2-дихлор-4-нитробензол; Е1А — этакриновая кислота; 4NQ — 4-нитрохинолин Л-оксид; 1РБ — транс-4-фенил-3-бутен-2-он; 180 — транс-стильбеноксид. # Автор для связи (тел.: +7 (8142) 57-18-79; факс: +7 (8142) 76-98-10; эл. почта: katsu@inbox.ru).
нием экологической ситуации в водоемах всего мира. Поэтому данных об особенностях регуляции, структуре и функциях GST гидробионтов, их сходстве с аналогичными энзимами млекопитающих существенно меньше, и они в значительной мере носят фрагментарный характер [8—16].
У большинства организмов обычно присутствует целый набор изоформ глутатион^-транс-фераз, которые могут отличаться друг от друга как в структурном, так и в функциональном отношении. Активные формы фермента представляют собой димеры с массой субъединиц 22—27 кДа [6].
Уже на ранних этапах изучения GST изофор-мы, наиболее сходные по строению и каталитическим свойствам, стали объединять в так называемые "классы", обозначаемые буквами греческого алфавита. В пределах одного класса белки могут кодироваться несколькими генами (в свою очередь имеющими несколько аллелей), что дает большое разнообразие вариантов экспрессируе-мых субъединиц [3, 17, 18]. Субъединицы ферментов, принадлежащих к одному классу, могут гибридизоваться между собой, образуя гомо- и ге-теродимеры, тем самым дополнительно увеличивая разнообразие изоформ фермента.
Спектр изоформ GST, экспрессируемых в клетке, вероятно, определяется особыми деток-сикационными требованиями той или иной ткани. Известно, что в печени крыс синтезируется
как минимум десять различных изоформ фермента, тогда как в плаценте человека обнаружена только одна [19]. На качественный и количественный состав экспрессируемых GST также оказывают влияние пол, возраст, физиологическое состояние организма, воздействие химических индукторов и т.д. [16].
В настоящее время известно по меньшей мере шестнадцать различных классов глутатион-S-трансфераз, восемь из которых специфичны для определенных таксонов организмов (бактерий, растений, насекомых и др.) [13, 17, 18]. У рыб обнаружены гены 7 различных классов GST (Альфа, Мю, Пи, Тета, Омега, Ро, микросомальные GST), один из которых (класс Ро) встречается только у рыб. Некоторые глутатион^-трансфера-зы рыб были выделены и охарактеризованы [816]. Полученные данные свидетельствуют о том, что различные изоформы GST рыб значительно различаются по субстратной специфичности, а следовательно, по своему значению в метаболизме токсинов различной химической природы.
Изучение роли GST в реализации механизмов защиты от чужеродных веществ расширяет знания о фундаментальных механизмах адаптации рыб к изменяющимся условиям среды и необходимо для разработки теоретических основ применения биохимических показателей для оценки здоровья водных организмов в условиях возрастающей антропогенной нагрузки.
Целью данной работы была идентификация GST из печени щуки Esox lucius [20], изучение некоторых физико-химических характеристик фермента, а также сравнение его с GST теплокровных позвоночных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате очистки GST методом аффинной хроматографии из печени щуки была получена одна изоформа фермента (рис. 1). Молекулярная масса нативного белка, определенная методом гель-фильтрации, составляла 53 ±3 кДа. При SDS-электрофорезе очищенная глутатион^-трансфе-раза мигрировала одной полосой, соответствующей белку с молекулярной массой 25 ± 0.5 кДа. Определение молекулярной массы фермента по результатам ВЭЖХ-МС/МС дало величину 25235.36 Да. Значение изоэлектрической точки фермента равно 6.4. Полученные результаты позволяют рассматривать выделенный нами фермент как гомодимер и хорошо соотносятся с литературными данными о строении глутатион^-трансфераз других организмов, в том числе, рыб [10, 13, 14, 16, 21-23].
Известно, что в зависимости от особенностей строения активного центра фермента, изоформы глутатион^-трансфераз могут различаться по
кДа
97 ■ - ^
66 ^
45 ш ®
30
20.1
14.4 „
12 3 4
Рис. 1. SDS-электрофорез препарата GST из печени щуки: 1, 3 — маркеры молекулярной массы (сверху вниз: фосфорилаза b, альбумин, овальбумин, карбо-ангидраза, ингибитор трипсина, а-лактальбумин); 2, 4 — очищенный фермент.
способности удерживаться на аффинной матрице, сшитой с глутатионом, такой как Glutathione Sepharose [24]. Например, отсутствие сродства к иммобилизованному глутатиону является специфической особенностью представителей GST класса Тета у млекопитающих [23]. Присутствие изоформ GST, которые не связываются с аффинной матрицей, также было показано в ряде работ, проведенных на других организмах [9, 25].
Значительный уровень активности GST в выходящем растворе после нанесения на аффинную матрицу (более 30% от активности при нанесении) может свидетельствовать о наличии в печени щуки других изоформ, обладающих слабым сродством к носителю Glutathione Sepharose. Показано, что доля фермента, удерживаемого аффинной матрицей, в цитозоле печени лососевых рыб составляет от 46 до 95% [11, 15, 22], лаврака Dicentrarchus labrax около 53% [10], тогда как у рисового угря Monopterus albus только 14% [26].
Анализ выделенной GST методом отпечатка пептидных масс показал, что полученный белок является продуктом трансляции мРНК глутатион-S-трансферазы 3 щуки (GenBank: ACO14264.1) [27]. Сравнение аминокислотной последовательности этого фермента с GST млекопитающих показало, что фермент относится к группе глутатион-S-трансфераз, классифицируемых как GST класса
elGSTAl
rGSTA4
rGSTA3
rGSTA5
rGSTA2
rGSTA6
rGSTAl
IN G RG К ME 3 X RWLLAv AGVE FEE VH LT К REE Y L KÍ KLYYFQ(3RGRME';I RWLLATñGVEFEEEFLET REQ YE K] PGKPVLHYFDGRGRHEPIRHLLAAAGVEFEEQFLKT RDD LA R1 PGKPVLHYFCGRGRMEFIRWLLAAAGVEFEEHFLKT RDD Lñ R] SGKPVLHYFNARGRME'VIRWLLAAAGVEFEIKLIQSPEDLEK] AEKPLFHYDEARGRHESVRWLLAAAGVEYEEKFIHTNEDLEK] 3GKPVLHYF N ARGRME'/I RWLLAA AGVEFDBKFIQSPED LE KI
, L3 D GE ЩYEQ VP L VEIDGMKLVQTКAIL£YIААКYH iQKDGCLLFGQVPLVEIDaULLTQTRAILEYIAAKYN iRJIDGSLMFQQVPLlVEIDGMKLVQTRAILUYIATKYtl iP.3DG3 I¿IFEQVP[1 VEIDGMKLVQTK AXLNYIATKYH KKdIhB'IFDQVPI] VEIDGHKLAQTP.AILIIYI ATKYD iRSDGV ШР Q Q VP НуДуДжКЬУд TRAIN 1IYFSSKYN 1К KDG HLHFDQ VP UVEIDGMKLAQTRAILNYIATКYD
80 80 80 80 80 80 80
elGSTAl rGSTA4 rGSTA3 rGSTA5 rGSTA2
rGSTA6 LiGKDNKEF.ALIDMY:'.:E rGSTAl
l r elmemihvlp fls
tqEmhmiigapfka vaBdei vlhypyi p v a dije lm vlyypym p i ldltehiiqlvicp ladlheh filypfd p ildltemi110lvicp
dakktkldeiksiatsi
qek esl lavkrak IR
gek a3 lj kikdkar URY
gek asl kikdkar URY
dqr акт lakdrtk HRY
gvk ahi lhkekat «RY
dqk акт lakdrtk HRY
-.VGH
J/GN
.VGN
„VGH ,VGH
.VGN
■iVGN
158 160 160 160 160 160 160
elGSTA1 veatlulee kfftilsef PA к f5a HKSL AIDKFLQP GS KRKE qp dvytktvfevlnlki 222
rGSTA4 leailmvee vsapvlsdf PL Q fkt I ni ti ÍKFLQPGSQRKE pp ghyvdvvrtvlkf 222
rGSTA3 vqvlyhvee ldpsaLAHF PL к lrt v N1 tv ÍKFLQPGSQRKE le ekcvesavkifs- 221
rGSTA5 vellyhvee mdpgivdhf PL к lrt v nl tv ÍKFLQPGSQRKE fd ekcvesakkifs- 221
rGSTA2 lelllyvee fdaslltpf PL К fks i EL hv ÍKFLQPGSQRK am akqieearkvfkf 222
rGSTA6 veuiymmee ldttli lahf PL Q lkt I dm ti ÍKFLQPGSQRQ pv eksiqktrkifkf 222
rGSTA1 lelllyvee fdaslltsf PL К fks I SL hv ÍKFLQPGSQRKLPV akqieearkifkf 222
Рис. 2. Сопоставление аминокислотных последовательностей глутатион-8-трансфераз щуки (еЮ8Т А1, транслировано с кодирующей последовательности субъединицы фермента, ОепВапк: АС014264.1) и крысы (г08Т А(1-6); КСВ1 RefSeq, соответственно: ОТ_001100310, ОТ_113697, ОТ_001009920, ОТ_001010921, ОТ_001019532, ОТ_058709). Цветом выделены высококонсервативные фрагменты, подчеркиванием — регион Н-сайта.
Альфа, и, в соответствии с номенклатурой, рекомендованной в работе [28], субъединица в составе фермента может быть обозначена как elGST A1, а гомодимер, соответственно, как elGST A1-1.
Обращает на себя внимание высокий уровень сходства первичных структур фермента из печени щуки и GST теплокровных животных (рис. 2). Так, идентичность аминокислотных посл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.