УДК 577.1
ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЕ АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦЫ №Д-АТРазы ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОКИСЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА ПРИВОДИТ К ИНГИБИРОВАНИЮ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА
© 2014 Мэн Сяньюй1, И.Ю. Петрушанко2, Е.А. Климанова1, Е.А. Дергоусова1, О.Д. Лопина1*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: (495)939-3955, электронная почта: od_lopina@mail.ru
2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32
Поступила в редакцию 01.11.13 После доработки 21.11.13
Установлено, что в частично очищенном препарате №,К-АТРазы из сердца крысы, где присутствуют а1- и а2-изоформы фермента, обе эти субъединицы представлены в S-глутатионилированном состоянии. Глута-тионилирование а1- (но не а2-субъединицы) частично устраняется, если препарат выделен в присутствии дитиотреитола. Добавление окисленного глутатиона инактивирует обе изоформы. Инактивация изофер-мента, содержащего а1-субъединицу, является двухфазной, константы скорости ингибирования составляют 3745 ± 360 и 246 ± 18 М-1 мин-1. ATP, ADP и AMP защищают №,К-АТРазу сердца от инактивации окисленным глутатионом.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: №,К-АТРаза, глутатионилирование, окисленный глутатион, сердце крысы.
№,К-АТРаза — это олигомерный белок, встроенный в плазматическую мембрану, который осуществляет активный транспорт ионов Na и К. Фермент состоит минимум из двух субъединиц: каталитической а-субъединицы (молекулярная масса около 100 кДа) и регуляторной в-субъединицы, представляющей собой гли-копротеид (молекулярная масса около 55 кДа). а-Субъединица является каталитической: она формирует трансмембранный канал для переноса ионов Na и К, а также обеспечивает гидролиз АТР и сопряжение этой реакции с переносом катионов против электрохимического градиента. в-Субъединица выполняет различные функции, включая направленную доставку комплекса ав к плазматической мембране от места синтеза [1]. Обе субъединицы прочно связаны друг с другом в стехиометрии 1:1. Кроме того, в состав ^,К-АТРазы в различных тканях могут включаться белки семейства FXYD (в частности, у-субъединица или фосфолеман), которые обеспечивают регуляцию чувствительности фермента к ионам Na и К и связывают ее с микротрубочками цитоскелета [2].
* Адресат для корреспонденции.
Градиент ионов N и К, создаваемый №,К-АТРазой, может использоваться клеткой в различных целях: для генерации потенциала действия, функционирования систем транспорта некоторых ионов (например, Н+ и Са2+), а также аминокислот, сахаров и нуклеотидов. Кроме того, Ма,К-ЛТРаза является единственным рецептором для кардиотонических стероидов, в частности, уабаина. Связывая их, она принимает участие в передаче сигнала, индуцированного этими соединениями [3]. Показано, что кардиотонические стероиды, которые первоначально были идентифицированы как вещества растительного происхождения, синтезируются в организме позвоночных животных и выполняют функции гормонов [4].
Известно четыре изоформы а- и три изоформы р-субъединиц Ма,К-АТРазы, которые кодируются различными генами и по-разному распределены в тканях, что, по-видимому, объясняется многообразием функций, выполняемых этим ферментом [5]. Различные изоформы а- и р-субъединиц могут сочетаться друг с другом в разных комбинациях, что приводит к появлению изоферментов Ма,К-АТРазы с различными свойствами, в частности, с различной
7
209
чувствительностью к уабаину, АТР, ионам натрия и калия, а также к протеолизу [6].
а 1-Субъединица является практически единственной, представленной в почках, хотя она присутствует во многих других тканях: в сердце и скелетной мускулатуре выявлены как а1-, так и а2-субъединицы, в мозге — а1-, а2- и аЗ-субъединицы. В сердце а2-субъединица, ин-гибируемая низкими концентрациями уабаина, вовлечена, по-видимому, в регуляцию транспорта Ca2+, осуществляемого через №,Са-об-менник [6].
В некоторых тканях №,К-АТРаза очень чувствительна к редокс-состоянию клетки и уровню кислорода в ней [7, 8]. Установлено, что перекись водорода вызывает окисление остатков цистеина в ферменте, что приводит к инги-бированию гидролиза АТР Ма,К-АТРазой [8], причем а2-изоформа фермента более чувствительна к окислению, чем а1-изоформа [9, 10]. До недавнего времени оставалось неясным, каким образом при изменении редокс-состояния клетки ингибируется активность №,К-АТРазы. Одно из предположений заключалось в том, что при изменении редокс-состояния клетки происходит необратимое окисление SH-групп фермента до -SO2H и -SO3H. Однако детальное исследование показало, что №,К-АТРаза выделяется из почек и солевых желез утки в глутатио-нилированном состоянии, что степень глутати-онилирования а 1-субъединицы в гомогенате сердца возрастает в условиях гипоксии [11].
Известно, что восстановленное состояние SH-групп белков цитоплазмы поддерживается за счет их взаимодействия с глутатионом, который представляет собой трипептид, включающий у-глютаминовую кислоту, цистеин и глицин (y-Glu-Cys-Gly). Две молекулы глутатиона, окисляясь, взаимодействуют друг с другом, образуя гексапептид, в котором два трипептида соединены -S—S-связями. Восстановление глутатиона может происходить под действием глута-тион-редуктазы, использующей NADPH в качестве кофактора. Концентрация восстановленного глутатиона (трипептида) в клетке находится в пределах 1—10 мМ [12]. Хотя в клетках млекопитающих около 98% глутатиона присутствует в восстановленной форме, и лишь около 2% — в окисленной (гексапептид), в некоторых ситуациях, например, при гипоксии и окислительном стрессе концентрация окисленного глутатиона может значительно возрастать [12].
В последнее время S-глутатионилирование белков (т.е. ковалентное связывание глутатиона с SH-группами белков за счет образования -S—S-связи) рассматривается как один из процессов неферментативной посттрансляционной моди-
фикации белков. С одной стороны, глутатиони-лирование играет важную роль в регуляции нормального состояния SH-групп, предохраняя их от необратимого окисления до -SO2H и -SO3H [12]. C другой стороны, этот процесс обеспечивает изменение свойств белка, что может приводить к изменению его функции. S-глутатиони-лирование может происходить вследствие реакции тиол-дисульфидного обмена между восстановленной SH-группой белка и окисленным глутатионом или другой глутатионилированной SH-группой белка, а также в результате прямого взаимодействия частично окисленной SH-груп-пы с восстановленным глутатионом, реакции между тиоловой группой и S-нитрозотиолами, окисленными формами глутатиона или его радикалами [12].
Ранее было показано, что глутатионилиро-вание в-субъединицы №,К-АТРазы по единственной восстановленной SH-группе (Cys 46) приводит к снижению активности фермента на 20%. Для глутатионилирования этого остатка цистеина в-субъединицы №,К-АТРазы кардио-миоцитов требуется пероксинитрит [13]. Известно, что а1-субъединица №,К-АТРазы содержит 23 остатка цистеина. Наши предыдущие исследования показали, что в а1-субъединице Na^-АТРазы из солевых желез утки значительная часть цитозольных SH-групп фермента (12 из 16) может быть глутатионилирована [11]. Глутатио-нилирование трех из них, расположенных вблизи АТР-связывающего центра фермента, приводит к полной потере ферментативной активности. До настоящего времени нет данных о том, глутатионилирутся ли а2-субъединица фермента в присутствии окисленного глутатиона, и может ли АТР и его аналоги защитить фермент от инактивации окисленным глутатионом.
Цель настоящей работы — изучение взаимодействия №,К-АТРазы из сердца крысы, содержащей а1- и а2-субъединицы, с окисленным глутатионом, и исследования влияния процесса глутатионилирования на активность фермента.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение частично очищенной фракции мик-росом из сердца крысы, обогащенной активностью ^Д-АТРазы. Фракцию микросом, обогащенную №,К-АТРазой, получали с использованием метода, предложенного Джонсом и соавт. [14].
Все операции проводили при температуре 0 — +4°. В основном использовали свежие сердца крыс линии Вистар весом более 200 г, в некоторых случаях сердце замораживали в жидком азоте и хранили до использования.
Сердца (обычно три—четыре) измельчали и гомогенизировали в 10 мМ растворе NaHCO3 (соотношение ткань : раствор = 1 : 7 по весу) 3 раза в течение 10 с с интервалами 15—20 с в гомогенизаторе типа Политрон. Гомогенат центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин, осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали 1 ч при 40 000 g. Полученный осадок суспендировали в растворе, содержащем 0,6 М KCl, 10 мМ имидазол-малеат, pH 6,8. Соотношение объема первоначально взятого NaHCO3 и объема раствора KCl составляло 3 : 2. Суспендирова-ние проводили в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.
Суспензию выдерживали в растворе KCl в течение 1 ч при перемешивании, после чего центрифугировали 1 ч при 40 000 g. Полученную фракцию микросом суспендировали в 1—3 мл раствора, содержащего 250 мМ сахарозы, 25 мМ имидазол и 1 мМ ЭДТА, pH 7,5, и замораживали в жидком азоте. Определяли концентрацию белка, после чего свежевыделенную или замороженную фракцию разводили 30 мМ раствором имидазола, pH 7,1, содержащим 0,3 мг/мл DSNa до концентрации белка 0,8—1 мг/мл. Инкубировали при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 30 мин, после чего центрифугировали при 105 000 g в течение 1 ч. Конечный осадок суспендировали в растворе 250 мМ сахарозы, 25 мМ имидазола и 1 мМ ЭDTA, pH 7,5. Хранили при —70° в течение 3—5 недель.
Белок определяли по методу Лоури и соавт. [15].
ATРазную активность определяли, измеряя концентрацию продукта реакции Pi по методу Ратбуна и Бетлах [16]. В реакционную среду, содержащую 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ ATP и имидазол 30 мМ (pH 7,4, доведенный HCl), вносили препарат частично очищенной фракции микросом из сердца крысы, содержащий 20 мкг белка. Объем пробы составлял 0,5 мл. Смесь инкубировали 10 мин при 37°. Предварительно было показано, что накопление Pi в этот промежуток времени происходит линейно. Активность Mg-АТРазы определяли по накоплению Pi в описанной выше ср
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.