МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2O14, том 48, № 4, с. 687-Ó95
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 57.O53
ГЛЮКОЗА В ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИМУЛИРУЕТ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧЕРЕЗ ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ В КУЛЬТУРЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ СЕРДЦА
ЧЕРЕЗ АКТИВАЦИЮ AMPK# © 2014 г. F. Chen1, W.-T. Zhao1, F.-X. Chen1, G.-S. Fu2, Y. Mou3, S.-J. Hu1*
1Institute of Cardiology, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou,
31OOO3, PR China
2Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou,
31OO12, PR China
3Department of Ultrasound, The Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 31OOO3, PR China
Поступила в редакцию 18.12.2013 г. Принята к печати 24.02.2014 г.
Фибробласты сердца, как известно, необходимы для адаптивных ответов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, а усиление межклеточных коммуникаций в миокардиальных клетках и фибробла-стах сердца выступает как ключевой фактор в поддержании функциональной целостности сердца. AMP-активируемая киназа (AMPK) — ключевая сигнальная киназа стресса — играет важную роль в выживании клеток и в усилении их функций. Однако лежащие в основе этих явлений связи между AMPK и щелевыми межклеточными контактами (GJIC) пока слабо изучены. В представленной работе связь между AMPK и GJIC в неонатальных фибробластах сердца, обработанных глюкозой в высокой концентрации, оценивали по миграции фибробластов, переносу красителя и экспрессии коннексина 43 (Cx43). 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-р^-рибофуранозид (AICAR) и соединение C (CC) использованы для регуляции активности AMPK. Уровни миграции клеток и экспрессии белка Cx43 в неонатальных фибробластах сердца возрастали в ходе обработки глюкозой в высокой концентрации, что сопровождалось улучшением передачи красителя. Кроме того, высокие концентрации глюкозы стимулировали обильное фосфорилирование AMPK. При ингибировании фосфорилирования AMPK с помощью CC снижались уровни переноса красителя, миграции клеток и экспрессии белка Cx43 в неонатальных фиб-робластах сердца, тогда как активация AMPK с помощью AICAR имитировала процессы, индуцируемые глюкозой в высокой концентрации: миграцию клеток, экспрессию белка Cx43 и усиление переноса красителя. Похоже, что AMPK участвует в регуляции GJIC в неонатальных фибробластах сердца, обработанных глюкозой в высокой концентрации, включая миграцию клеток, перенос красителя, экспрессию и распределение Cx43.
Ключевые слова: щелевой межклеточный контакт, Сх43, АМРК, крысиные неонатальные фибробласты сердца, миграция клеток.
HIGH GLUCOSE PROMOTES GAP JUNCTIONAL COMMUNICATION IN CULTURED NEONATAL CARDIAC FIBROBLASTS VIA AMPK ACTIVATION, by F. Chen1, W.-T. Zhao1, F.-X. Chen1, G.-S. Fu2, Y. Mou3, S.-J. Hu1* ^Institute of Cardiology, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, PR China; *E-mail: s0hu0001@hotmail.com, riverapt@126.com; 2Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310012, PR China; 3Department of Ultrasound, The Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, PR China). Cardiac fibroblasts are known to be essential for adaptive responses in the patho-genesis of cardiovascular diseases, and increased intercellular communication of myocardial cells and cardiac fibroblasts acts as a crucial factor in maintaining the functional integrity of the heart. AMP-activated kinase (AMPK) is a key stress signaling kinase, which plays an important role in promoting cell survival and improving cell function. However, the underlying link betWeen AMPK and gap junctional communication (GJIC) is still poorly understood. In this study, a connection between AMPK and GJIC in high glucose-mediated neonatal cardiac fibroblasts was assessed using fibroblast migration, measurement of dye transfer and connexin43
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: s0hu0001@hotmail.com, riverapt@126.com
(Cx43) expression. 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-p-D-ribofuranoside (AICAR) and Compound C (CC) were used to regulate AMPK activity. The levels of cell migration and Cx43 protein expression in neonatal cardiac fibroblasts increased during high glucose treatment, accompanied by developed dye transfer. In addition, high glucose induced abundant phosphorylation of AMPK. Suppression of AMPK phosphorylation using CC reduced dye transfer, cell migration and Cx43 protein expression in neonatal cardiac fibroblasts, whereas the activation of AMPK using AICAR mimicked the high glucose-mediated cell migration, Cx43 protein expression and dye transfer enhancement. AMPK appears to participate in regulating GJIC in high-glucose-treated neonatal cardiac fibroblasts, including cell migration, dye transfer, Cx43 expression and distribution.
Keywords: gap junctional communication, Cx43, AMPK, neonatal rat cardiac fibroblasts, cell migration. DOI: 10.7868/S0026898414040028
ВВЕДЕНИЕ
Фибробласты сердца составляют примерно 70% от общего числа клеток сердца [1]. Предполагается, что кроме продуцирования коллагена и фибронектина для репарации повреждений фибробласты играют важную роль в ходе адаптивных или негативных реакций организма при сердечнососудистых заболеваниях [2, 3]. Фибробласты могут дифференцироваться в миофибробласты; сек-ретируют некоторые цитокины, в том числе эндо-телин-1, фактор ингибирования лейкоза, интер-лейкин-6, кардиотрофин-1 и периостин; мигрируют в зону повреждения; индуцируют гипертрофию кардиомиоцитов [3, 4], тем самым обусловливая негативный ответ. В противоположность этому, делетирование специфичного к фибробла-стам сердца гена klf5 изменяет гипертрофическую реакцию и фиброз, вызванный избыточным давлением [3]. Недостаточный уровень дифференциров-ки фибробластов в миофибробласты подавляет ре-моделирующий ответ у пожилых мышей с инфарктом миокарда [5]. Кроме того, показано, что фибробласты переключаются на преждевременно стареющий фенотип в диабетических моделях, что сопровождается усиленным межклеточным взаимодействием через щелевые контакты (gap junctional intercellular communication, GJIC), снижением продукции коллагена и замедленным заживлением ран [6]. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что при сердечно-сосудистых заболеваниях фибробла-сты обеспечивают адаптивный ответ.
Щелевые контакты фибробластов способствуют миграции клеток, их пролиферации, секреции и дифференцировке. Показано, что изменения в GJIC сопровождают различные патофизиологические процессы [1, 7]. Так, каналы щелевых контактов формируются из кластеров коннексинов (Cx), а Cx43 представляет собой основной кон-нексин фибробластов сердца [6, 8]. Ранее выявлено, что экспрессия Cx43 положительно и отрицательно регулируется при стрептозоцин-индуциро-ванном диабете у крыс или в кардиомиоцитах, культивируемых при высоком содержании глюкозы [9—11]. А это предполагает, что щелевые контакты тесно связаны с дисфункцией сердца у крыс,
больных диабетом. При этом щелевые контакты фибробластов, вносящие существенный вклад в развитие нормальной функции сердца, слишком слабо изучены в различных стрессовых условиях.
В данной работе оценена роль GJIC неона-тальных фибробластов сердца в условиях высокого содержания глюкозы. АМР-активируемая ки-наза (АМРК) — высоко консервативный белок, поддерживающий клеточный гомеостаз, в том числе регулирующий рост, пролиферацию, ауто-фагию и энергетику клеток [12, 13]. Удаление АМРК оказывает серьезное негативное влияние на работу сердца в стрессовых условиях [14, 15]. Недавно показано, что активация АМРК вовлечена в фиброз сердца и усиливает образование рубцов у пожилых мышей с реперфузированным инфарктом миокарда [5, 15]. Так что АМРК, по-видимому, играет определенную роль в жизненном цикле клеток сердечных фибробластов. Однако взаимосвязь между АМРК и щелевыми контактами фибробластов пока не исследована.
Перед нами стояла задача исследовать влияние глюкозы в высокой концентрации на щелевые контакты неонатальных фибробластов сердца и изучить механизм участия АМРК в этом процессе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. Краситель люциферовый желтый (Lucifer yellow, LY), глюкоза, 2',6'-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), коллагеназа II, трипсин, краситель кристаллический фиолетовый (crystal violet) и первичные антитела анти-Сх43 приобретены у компании "Sigma" (США). Соединение С (Compound С, СС), или дорсоморфин, и 5-ами-ноимидазол-4-карбоксамид-1-Р^-рибофурано-зид (AICAR) приобретены у "Merck" (Германия). Первичные антитела против фосфо-AMPK, AMPK, Р-актина и все вторичные антитела приобретены у компании "Epitomics" (США). Среды DMEM (с концентрацией глюкозы 5.5 мМ) и FBS приобретены у "Invitrogen" (США).
Культура неонатальных фибробластов сердца. Для получения фибробластов сердца использованы новорожденные, в течение 48 ч после рожде-
ния, SD (Sprague-Dawley) крысы из Экспериментального центра животных Чжэцзянского университета (Experimental Animal Center of Zhejiang University, Китай). Ткани сердца разрезали на фрагменты по 1 мм3 и обрабатывали 1%-ным трипсином и 1%-ной коллагеназой II при 37°C. Суспензию клеток высевали в 6-луночные планшеты, содержащие культуральную среду DMEM и 10% FBS. После адгезии в течение 1 ч супернатант удаляли, вновь добавляли DMEM с 5% FBS и выращивали фибробласты во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2/95% воздуха, при 37°C. После достижения 85—90% конфлуэнтности (3—4 сут) клетки использовали для соответствующих измерений.
Миграция неонатальных фибробластов сердца.
Миграцию фибробластов изучали, используя систему Transwell ("Corning"). После того, как в нижнюю камеру поместили 1 мл среды DMEM, содержащей 1% FBS, в верхнюю камеру добавляли 500 мкл суспензии клеток, содержащей 1% FBS, в концентрации 1 х 105 клеток/мл. В среду в нижней камере добавляли либо не добавляли глюкозу в высокой концентрации (33 мМ), или же регуляторы AMPK (AICAR либо CC). После инкубации в течение 24 ч прикрепившиеся к верхней стороне мембранного фильтра клет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.