БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып.. 2, с. 185 - 192
УДК 577.352
ГЛЮКОЗНАЯ ДЕПРИВАЦИЯ СТИМУЛИРУЕТ
ПРОДУКЦИЮ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В МИТОХОНДРИЯХ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ ЗЕРНИСТЫХ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА*
© 2008 г. Н.К. Исаев12**, Е.В. Стельмашук2, У. Дирнагл3, Е.Ю. Плотников1, Е.А. Кувшинова1, Д.Б. Зоров1
1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, ГСП-2; факс: (495)939-3181, электронная почта: isaev@genebee.msu.su 2 ГУ НИИ неврологии РАМН, 105064 Москва, пер. Обуха, 5 3 Department of Neurology, Charite Hospital, Humboldt University, Germany; E-mail: ulrich.dirnagl@charite.de
Поступила в редакцию 22.05.07 После доработки 05.07.07
С использованием гидроэтидина, флуоресцентного зонда для определения супероксида, установлено, что глюкозная депривация (ГД) стимулирует продукцию активных форм кислорода (АФК) в культивированных зернистых нейронах мозжечка. Показано, что продукция АФК нечувствительна к блокаде ионотропных глутаматных рецепторов МК-801 (10 мкМ) и NBQX (10 мкМ). Продемонстрировано, что ингибиторы транспорта электронов в митохондриях, такие как ротенон (комплекс I), антимицин А (комплекс III), азид натрия (комплекс IV), ингибитор митохондриальной ATP синтазы олигомицин, разобщитель окислительного фосфорилирования CCCP, хелатор ионов внутриклеточного кальция — BAPTA, ингибитор электрогенного транспорта Ca2+ в митохондрии — рутениевый красный, а также пируват снижают индуцированную ГД продукцию АФК в нейронах. Показано, что ГД сопровождается снижением мембранного потенциала митохондрий и ростом концентрации свободного кальция в цитоплазме. Пируват, BAPTA и рутениевый красный снижают индуцированную ГД кальциевую перегрузку нейронов, а пируват и рутениевый красный предотвращают также изменение мембранного потенциала митохондрий. Сделан вывод, что индуцированная ГД продукция АФК в нейронах связана с потенциалзависимой кальциевой перегрузкой митохондрий. Последняя в комбинации с истощением энергетических субстратов может приводить к снижению мембранного потенциала этих органелл.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гипогликемия, активные формы кислорода, митохондрия, кальций, зернистые нейроны мозжечка, клеточная культура.
АФК являются не только важным фактором нейрональной гибели, индуцированной различными патологиями, включая старение [1—4], но также важными сигнальными молекулами, во-
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода, ГД — глюкозная депривация, МК-801 — (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(а,ё)циклогептен-5,10-имин малеат^ВрХ — 2,3-диоксо-6-нитро-1,2,3,4-тетра-гидробензохиноксалин-7-сульфоноамид,КЗН — культивированные зернистые нейроны, CCCP — карбонил цианид м-хлорофенилгидразон, СРС — сбалансированный солевой раствор, NMDA — N-метил-Б-аспартат, ТМРЭ — эфир тетраметилродамина.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, ВМ 07-155, 11.11.2007.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
влеченными в синаптическую передачу при нормальном клеточном метаболизме [5, 6]. Интенсивная продукция АФК и активация окислительных процессов в клетках мозга может быть не только результатом усиления продукции АФК, но и является следствием снижения активности антиоксидантных систем, которое может происходить, например, при внутриклеточном дефиците глюкозы, индуцированном гипогликемией [7]. Известно, что митохондриям принадлежит главная роль в развитии окислительного стресса, как органеллам, продуцирующим наибольшее количество АФК в клетке, как при физиологических, так и при патологических условиях [8—10]. Большинство заболеваний мозга могут приводить к нарушению функций митохондрий и регуляции окислительного мета-
болизма в нейронах [11—14]. Однако роль митохондрий в продукции АФК в условиях дефицита субстратов окислительного метаболизма не совсем ясна. В настоящей работе, используя флуоресцентные зонды на супероксид, ионы кальция и мембранный потенциал митохондрий, исследовали влияние ГД на продукцию супероксида нейронами. В частности, мы проверяли влияние ингибиторов транспорта электронов на эти параметры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все среды и добавки к ним, использованные для клеточных культур, были получены от «Biochrom» (Германия). Fluo-3 AM, гидроэтидин и эфир тетраметилродамина — от «Molecular Probes» (США). Другие реагенты предоставлены «Sigma Chemicals» (Германия).
Первичные культуры мозжечка. Исследование выполнено на семи-девятидневных культурах зернистых нейронов мозжечка, полученных из мозга восьмисуточных крыс линии Wistar методом ферментно-механической диссоциации. Диссоциацию ткани мозга проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37° в фосфатном буфере, содержавшем 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера Нереs, pH 7,2—7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ре-суспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах, покрытых полилизином. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО2-инкубаторе, при температуре 35,5° и относительной влажности 98%.
На второй день культивирования среда заменялась свежей, содержавшей 25 мМ KCl, в этой среде клетки развивались до 7—8 дня. Чтобы предотвратить пролиферацию не нейрональных клеток в среду культивирования на второй день in vitro добавляли 1 мкМ арабинозидмоноцито-зида.
Обращение с животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с интернациональным руководством заботы о животных.
Глюкозная депривация. Для инициации ГД, культивированные клетки дважды отмывали сбалансированным солевым раствором (СРС), содержавшим (в мМ): NaCl 154, KCl 25, CaCl2 2,3, MgCl2 1, NaHCO3 3,6, Na2HPO4 0,35, Hepes 10, при pH 7,2—7,4, и инкубировали 15—60 мин. Контрольные культуры инкубировали в СРС с добавлением глюкозы (1 г/л).
Внутриклеточное измерение АФК, ионов кальция и мембранного потенциала митохондрий. Для определения продукции супероксида клетки инкубировали с 1 мкМ гидроэтидина 40 мин. Флуоресценцию продукта окисления гидроэтидина возбуждали светом с длиной волны 530 нм и регистрировали эмиссию в диапазоне 640 нм. Для анализа изменений мембранного потенциала митохондрий клетки инкубировали с 0,1 мкМ эфира тетраметилродамина (ТМРЭ, возбуждение 530 нм, эмиссия 640 нм) 15—30 мин, а для измерения [Ca2+]j с 10 мкМ Fluo-3 AM (возбуждение 485 нм, эмиссия 530 нм) 60 мин. Инкубацию со всеми зондами производили при 36,5 ± 0,5° с последующей трехкратной промывкой СРС.
Продукцию свободных радикалов, мембранного потенциала митохондрий и изменения [Ca2+]j измеряли с помощью флуоресцентного ридера Су1^!иог II («PerSeptive Biosystems», США).
Флуоресцентная микроскопия. Во всех экспериментах флуоресценцию клеток контролировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа («Leica, Geosystems», Швейцария) с фильтрами для ТМРЭ и продукта окисления гидроэтидина 530/640 нм, и 485/ >530 нм для Fluo-3.
Статистический анализ. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с посттестом Bonferroni или Dunnett, при уровне значимости p < 0,05. Результаты выражали как среднее ± SEM. Все данные получены не менее чем на 12 культурах из трех независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глюкозная депривация индуцирует возрастание продукции АФК в зернистых нейронах мозжечка. Мы использовали гидроэтидин как индикатор уровня АФК в КЗН. Инкубация КЗН в СРС без глюкозы вызывала интенсивную продукцию АФК (рис. 1). Известно, что в нейро-нальных культурах при гипогликемии аккумулируется эндогенный глутамат [15, 16], который активирует ионотропные глутаматные рецепторы и вызывает в нейронах продукцию АФК [3, 4, 17]. Чтобы определить, опосредована ли продукция АФК активацией ионотропных глута-матных рецепторов, в инкубационный раствор
Рис. 1. Глюкозная депривация стимулирует продукцию супероксид аниона в зернистых нейронах мозжечка, которая не чувствительна к действию блокаторов ионотропных глу-таматных рецепторов МК-801 (10 мкМ) и МВрХ (10 мкМ). Относительный уровень супероксид аниона в культурах представлен как процент флуоресценции гидроэтидина в эксперименте относительно контроля (СРС с глюкозой в отсутствии МК-801 и МВрХ). Белые колонки — СРС, черные - СРС с МК-801 и ШРХ. *р < 0,001 по сравнению с контролем
были добавлены блокаторы этих рецепторов (MK-801 и NBQX). Полученные данные показали, что блокада ионотропных глутаматных рецепторов при ГД достоверно не снижает продукцию АФК в КЗН (рис. 1).
ГД модулирует внутриклеточное содержание ионов кальция и мембранный потенциал митохондрий. Используя флуоресцентный зонд на [Ca2+]j, Fluo-3, мы показали, что 60 мин инкубации КЗН в присутствии блокаторов ионотроп-ных глутаматных рецепторов (MK-801 и NBQX) и отсутствии глюкозы приводит к постепенному возрастанию [Са2+] (рис. 2). Мембранный потенциал митохондрий регистрировали в сестринских культурах, используя флуоресцентный зонд ТМРЭ. Эксперименты показали, что 60-минутная ГД вызывала падение мембранного потенциала митохондрий в этих клетках (рис. 2).
Митохондриальные ингибиторы снижают формирование АФК, но увеличивают концентрацию внутриклеточного кальция при ГД. Известно, что митохондриям принадлежит главная роль в развитии окислительного стресса, как основным органеллам, генерирующим АФК в клетках [10, 18—20]. Исходя из этих данных мы предположили, что при ГД в КЗН избыточное формирование АФК происходит в митохондриях. Чтобы проверить это предположение, в среду инкубации, лишенную глюкозы, добавляли ингибиторы комплексов I, III и IV дыхательной цепи: ротенон, антимицин A и азид натрия соответственно, ингибитор ATP-синтазы — олигоми-
цин, разобщи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.