НЕИРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 2, с. 171-175
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.352.4
ГОМЕОСТАЗ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ НАРУШАЕТСЯ В МОЗЖЕЧКЕ, НО НЕ В ДРУГИХ ОТДЕЛАХ МОЗГА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПЕРАММОНИЕМИИ © 2014 г. Ю. Г. Каминский1, *, Е. А. Косенко1' 2
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино
Исследовали влияние хронической гипераммониемии, вызываемой потреблением ацетата аммония с кормом, на гомеостаз митохондриального кальция в неокортексе, мозжечке, гиппокампе и стриатуме крысы. Показано, что хроническая умеренная гипераммониемия приводит к повышению содержания эндогенного кальция, снижению кальциевой емкости, скорости поглощения Са2+ в митохондриях мозжечка, скоростей №+-зависимого и гидропероксид-зависимого высвобождения Са2+ из этих митохондрий. Нарушения гомеостаза митохондриального Са2+ не происходят в неокортексе, гиппокампе и стриатуме. Таким образом, только митохондрии мозжечка in vivo чувствительны к пищевым солям аммония и только в мозжечке повреждается митохондриальная система транспорта Са2+ при хронической гипераммониемии.
Ключевые слова: аммиак, хроническая гипераммониемия, митохондрии мозга, мозжечок, транспорт кальция.
DOI: 10.7868/S1027813314020058
ВВЕДЕНИЕ
Гипераммониемия является главным фактором в патогенезе острой гепатоэнцефалопатии [1—3]. Механизм токсичности аммиака остается невыясненным. Аммиачная интоксикация связана с развитием окислительного стресса в мозге [4], а нарушение гомеостаза митохондриального кальция является главной причиной окислительного повреждения клетки [5, 6]. Относительно внутриклеточного обмена кальция в мозге при гипераммониемии известно немного. Только в наших ранних исследованиях было показано, что острое введение аммиака приводит к изменениям в транспорте Ca2+ в митохондриях переднего мозга крысы [7, 8]. Влияние хронического введения аммиака на транспорт Ca2+ в митохондриях разных отделов мозга не описано в литературе.
В данной работе мы измерили содержание и потоки Ca2+ в митохондриях, выделенных из четырех разных отделов мозга контрольных крыс и животных с хронической гипераммониемией. Результаты показали, что стационарная концентрация Ca2+, скорости поглощения Ca2+, скорости спонтанного, №+-зависимого и индуцируемого трет-бутилгидропероксидом выхода Ca2+ изменя-
*Адресат для корреспонденции: 142290, Пущино, Институтская ул., 3; тел.: (496) 7735246; e-mail: kaminsky@iteb.ru.
ются при хронической гипераммониемии только в митохондриях мозжечка, но остаются неизменными в митохондриях неокортекса, гиппокампа и стриатума.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные процедуры выполнены в соответствии с Европейскими Правилами по использованию лабораторных животных 1986 г. (Правила лабораторной практики в РФ. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 № 267).
Половозрелые крысы Вистар получали стандартный или богатый аммиаком корм в течение 28 дней перед началом эксперимента; процедуры описаны Косенко с сотр. [9]. Аммиачный корм отличался от стандартного добавлением 20 массовых процентов ацетата аммония. Затем из не-окортекса, мозжечка, гиппокампа и стриатума выделяли несинаптические митохондрии и оценивали в них показатели гомеостаза Са2+, как описано ранее [7, 8]. Транспорт Са2+ регистрировали непосредственно в суспензии митохондрий с помощью ион-селективного электрода Orion 93—20 в термостатируемой кювете при 25°C. Для энергообеспечения транспорта Са2+ использовали 5 мМ сукцинат (вместе с 1 мкМ ротеноном),
172
КАМИНСКИЙ, КОСЕНКО
Таблица 1. Содержание аммиака в крови и отделах мозга в контрольных условиях и после 28 дней скармливания ацетата аммония
Аммиак, мкмоль/1 г ткани
Ткань
контроль аммиак
Кровь 0.25 ± 0.04 0.51 ± 0.05**
n = 6
Неокортекс 0.35 ± 0.04 0.50 ± 0.07
Мозжечок 0.49 ± 0.04+ 0.80 ± 0.10*
n = 6
Гиппокамп 0.39 ± 0.06 0.49 ± 0.11
Стриатум 0.58 ± 0.06++ 0.56 ± 0.09
Приведены средние значения и стандартные ошибки для п = 4 (кроме указанных значений п = 6). * р < 0.05, ** р < 0.01 при сравнении с контролем (¿-тест Стьюдента); +р < 0.05, ++р < 0.01 при сравнении с показателем крови (¿-тест Стьюдента с поправкой Бонферрони).
так как другие субстраты не поддерживают энергозависимый транспорт Са2+ в митохондриях [7, 8]. Концентрацию аммиака в кислотных экстрактах тканей определяли флуориметрически по окислению NADH в глутаматдегидрогеназной реакции [10].
Результаты выражали как среднее значение и стандартная ошибка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Prizm 5.0 для Windows (GraphPad Software, США). Нормальность распределения переменных подтвердили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова (для показателей не-окортекса и мозжечка при n = 6) или предположили по аналогии (для гиппокампа и стриатума при n = 3). Парные сравнения проводили по непараметрическому критерию Манна—Уитни, а различия между тканями анализировали методом
ЛМОУЛ с использованием ¿-критерия Стьюдента для множественных сравнений и поправки Бонферрони.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В разных отделах мозга животных контрольной группы концентрации аммиака неодинаковы, но во всех тканях они выше концентрации аммиака в крови (в единицах мкмоль на 1 г ткани) (табл. 1); это превышение достоверно для мозжечка и стриатума.
Скармливание крысам ацетата аммония приводит к устойчивой умеренной гипераммоние-мии: концентрация аммиака в крови повышается от 0.25 до 0.51 мМ (р = 0.0077) (табл. 1).
При хроническом потреблении аммиачного корма содержание аммиака достоверно увеличивается только в мозжечке (р = 0.034), а в других отделах мозга оно сохраняется статистически неизменным (табл. 1).
В несинаптических митохондриях неокортек-са, мозжечка, гиппокампа и стриатума содержится 10—11.5 нмоль эндогенного Са2+ на 1 мг белка (табл. 2, рисунок), что находится в соответствии с результатами измерения содержания Са2+ в митохондриях переднего мозга крысы [8] и с данными Ротенберга и Марбаха, полученными на целом мозге крысы методом атомно-абсорбционной спектроскопии [11].
Для наглядности показатели гомеостаза Са2+ в митохондриях мозжечка приведены на рисунке. На этом рисунке показано, что умеренная хроническая гипераммониемия вызывает достоверное увеличение содержания эндогенного Са2+ в митохондриях мозжечка от 11.5 до 14.5 нмоль на 1 мг белка (на 26%, р < 0.01), а в митохондриях других отделов мозга содержание эндогенного Са2+ не меняется (табл. 2).
Таблица 2. Показатели гомеостаза Са2+ в митохондриях разных отделов мозга контрольных крыс и животных, потреблявших аммиачный корм
Отдел мозга Условия Эндогенный Ca2+, нмоль/ 1 мг белка Поглощение Ca2+, нмоль/ мин на 1 мг белка Ca2+-емкость, нмоль/1 мг белка Выход Ca2+, нмоль/мин на 1 мг белка
спонтанный №+-зависи-мый БГ-зависи-мый
Неокортекс n = 6 Контроль Аммиак 10 ± 1.1 11.5 ± 0.6 78.3 ± 2.4 70.8 ± 2.6 71 ± 6 60.8 ± 2.6 4.5 ± 0.4 5.1 ± 0.8 21.8 ± 3.3 19.9 ± 2.9 5.5 ± 1.2 5 ± 0.7
Гиппокамп n = 3 Контроль Аммиак 11.6 ± 0.4 11.3 ± 1 73.3 ± 3.9 69.7 ± 6.5 72.7 ± 7.7 67.7 ± 6.7 3.9 ± 0.4 4.1 ± 1 5.7 ± 1.1 4.9 ± 1.1
Стриатум n = 3 Контроль Аммиак 11 ± 1.2 10.9 ± 1.4 69 ± 6.9 73.3 ± 4.8 65 ± 7 65.7 ± 4.5 4.9 ± 0.7 4.5 ± 0.7 5.4 ± 0.9 5.3 ± 1.3
Приведены средние значения и стандартные ошибки для указанного числа п при двукратном измерении каждого параметра. БГ — трет-бутилгидропероксид. Все различия между контрольной и группой "Аммиак", а также между тканевыми показателями недостоверны.
Контроль Аммиак Контроль Аммиак Контроль Аммиак
Эндогенный Са2+, кальциевая емкость митохондрий, скорость поглощения Са2+ в митохондриях, скорости спонтанного выхода, Ка+-зависимого выхода и индуцируемого трет-бутилгидропероксидом (БГ) выхода Са из митохондрий мозжечка контрольных крыс и животных, потреблявших аммиачный корм. Приведены средние значения и стандартные ошибки для п = 6. **р < 0.01, ***р < 0.001 при сравнении с контролем.
Скорость энергозависимого поглощения Ca2+ в митохондриях всех четырех отделов мозга контрольных животных варьирует между 69 и 82 нмоль/мин на 1 мг белка, как и в митохондриях переднего мозга [8]. При хронической гипераммониемии эта скорость снижается только в митохондриях мозжечка (на 18%, p < 0.001) (рисунок) и не меняется в других отделах мозга (табл. 2).
Кальциевая емкость митохондрий, выделенных из любого отдела мозга, составляет от 65 до 76 нмоль Ca2+ на 1 мг белка, как и кальциевая емкость митохондрий переднего мозга [8]; статистических различий между отделами не обнаружено. Кальциевая емкость митохондрий мозжечка крыс, потреблявших аммиачный корм, значительно меньше контрольного значения (на 25%, p< 0.001) (рисунок), тогда как этот показатель в митохондриях неокортекса, гиппокампа и стриа-тума не изменяется после потребления аммиака с кормом (табл. 2).
Когда ионы Са2+ поглощаются в митохондриях в энергозависимом процессе (поддерживаемом окислением сукцината) в количествах, превышающих кальциевую емкость митохондрий, избыточный Са2+ спонтанно выходит из нагруженных
митохондрий. Скорость спонтанного выхода Са2+ из нагруженных кальцием митохондрий мозжечка составляет 4.5 ± 0.5 нмоль/мин на 1 мг белка в контроле, но достоверно выше в митохондриях мозжечка крыс, потреблявших аммиачный корм (на 22%, p < 0.01) (рисунок). Скорость спонтанного выхода Са2+ из нагруженных кальцием митохондрий других отделов мозга не меняется при хронической гипераммониемии (табл. 2).
Добавление NaCl к митохондриям мозжечка после начала спонтанного выхода Са2+ стимулирует выход Са2+ до 22.5 ± 1.1 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход Ca2+ из митохондрий мозжечка животных с хронической гипераммониемией после добавления NaCl (или №+-зависимый выход) происходит со скоростью 17.5 ± 0.7 нмоль/мин на 1 мг белка, что достоверно меньше контрольного значения (на 22%, p < 0.01) (рисунок). Скорость №+-зависимого выхода Са2+ из нагруженных кальцием митохондрий других отделов мозга не меняется при гипераммониемии (табл. 2).
Агенты, изменяющие редокс-состояние мито-хондриальных пиридиннуклеотидов, могут изменять
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.