МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 2, с. 247-257
ГЕНОМИКА. ТРАНКСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 577.21:579.23
ГОМОЛОГИ ГЕНА AlkB ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА Geobacillus
© 2008 г. Т. П. Турова1, Т. Н. Назина1*, Е. М. Михайлова1, Т. А. Родионова2, А. Н. Екимов2, А. В. Машукова3, А. Б. Полтараус2
1Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва, 117312 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 117984 3Факулътет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 Поступила в редакцию 01.10.2007 г.
Принята к печати 29.11.2007 г.
Осуществлен поиск генов, кодирующих алкан-гидроксилазы (гены alkB), у термофильных аэробных бактерий рода Geobacillus. Из биомассы 11 штаммов, выращенных на смеси насыщенных углеводородов С10-С20, выделена тотальная ДНК, амплифицированы фрагмены alkB-генов с использованием вырожденных праймеров, ПЦР-продукты клонированы и секвенированы. Впервые в геноме термофильных бактерий обнаружено несколько различающихся последовательностей, гомологичных alkB-генам. В отдельных штаммах геобацилл содержится от трех до шести гомологов, из которых только два универсальны для всех штаммов. Сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и полученных с помощью компьютерной трансляции аминокислотных последовательностей выявил сходство шести вариантов alkB-гомологов геобацилл с генами alkB4, alkB3 и alkB2, обнаруженными ранее другими авторами у штаммов Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 и Q15. Все alkB-варианты последовательностей alkB-гомологов геобацилл оказались уникальными. По GC-соста-ву эти гомологи более сходны с хромосомной ДНК родококков, чем с хромосомной ДНК геобацилл. Это свидетельствует о том, что alkB-гены могли попасть в геном геобацилл путем межвидового горизонтального переноса, а родококки или другие представители класса Actinobacteria, возможно, выступали в качестве доноров этих генов. Анализ использования кодонов для фрагментов alkB-генов показывает, что пул этих генов является общим для большинства грамположительных и некоторых грамотри-цательных бактерий. Присутствие нескольких гомологов генов alkB в геноме одного микроорганизма может быть результатом свободного обмена этими генами внутри общего пула.
Ключевые слова: гены alkB, гомологи, термофильные бактерии, Geobacillus., горизонтальный перенос генов.
AlkB HOMOLOGUES IN THERMOPHILIC BACTERIA OF THE GENUS Geobacillus, by T. P. Tourova1, T. N. Nazina1*, E. M. Mikhailova1, T. A. Rodionova2, A. N. Ekimov2, A. V. Mashukova3, A. B. Poltaraus2 (1Winogradsky Institute of Microbiology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117312 Russia; *e-mail: nazina@inmi.host.ru; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117984 Russia; 3Department of Bioengineering and Bioinformatics, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia). Screening of alkane hydroxylase genes (alkB) was performed in the thermophilic aerobic bacteria of the genus Geobacillus. Total DNA was extracted from the biomass of 11 strains grown on the mixture of saturated C10-C20 hydrocarbons, PCR amplification of fragments of alkB genes was performed with degenerate oligonucleotide primers, PCR products were cloned and sequenced. For the first time in the genome of thermophilic bacteria the presence of a set of alkB gene homologues was revealed. The strains each contain three to six homologues among which only two are universal for all of the strains. Comparative phylogenetic analysis of the nucleotide sequences and the inferred amino acid sequences showed close relatedness of six of the revealed variants of geoba-cilli sequences to the alkB4, alkB3, and alkB2 genes that had previously been revealed by other authors in Rhodococcus erythropolis strains NRRL B-16531 and Q15. The rest two variants of alkB sequences were unique. Analysis of the GC composition of all the Geobacillus alkB homologues revealed closer proximity to the rhodococcal chromosomal DNA than to the chromosomal DNA of geobacilli. This may be an indication of the introduction of the alkB genes into the Geobacillus genome by interspecies horizontal transfer; and rhodococci or other representatives of the Actinobacteria phylum were probably the donors of these genes. Analysis of the codon usage in fragments of alkB genes confirms the suggestion that the pool of these genes is common to the majority of Gram-positive and certain Gram-negative bac-
* Эл. почта: nazina@inmi.host.ru
teria. Formation of a set of several alkB homologues in a genome of a particular microorganism may result from free gene exchange within this pool.
Key words: alkB genes, homologues, thermophilic bacteria, Geobacillus, horizontal gene transfer.
CßefleHHÜ о генах, ответственных за биодеградацию н-алканов и других углеводородов у термофильных бактерий в литературе немного. Процесс окисления н-алканов детально исследован только у мезофильных бактерий [1, 2]. В реакции окисления алканов участвует трехкомпонентная ферментная система - алкан-гидроксилаза, содержащая три белка. Основным является алкан-монооксигеназа, фермент, который непосредственно вводит атом кислорода в концевой атом н-алкана. Два других белка, рубредоксин и рубре-доксинредуктаза, обеспечивают алкан-моноокси-геназу энергией в результате переноса электронов от NADH.
Особенности alk-генов и их белковых продуктов исследованы у мезофильных грамотрица-тельных бактерий родов Pseudomonas [P. putida GPol (=P. oleovorans), P. aeruginosa], Acinetobacter, Stenotrophomonas, Alcanivorax и Burkholderia, а также у грамположительных бактерий родов Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia и Prauserella [3-7]. В геномах мезофильных бактерий, принадлежавших к различным видам и родам, обнаружены наборы alkB-ге-нов, значительно различающихся между собой [2, 6, 7]. Например, штаммы рода Rhodococcus (NRRL B-16531 и Q15), выделенные из различных географических регионов, содержат, по меньшей мере, по четыре гомолога генов алкан-гидроксилаз (alkBl, alkB2, alkB3 и alkB4) [7]. Функциональные различия между продуктами различных alkB-генов до сих пор не ясны. Анализ генов штамма Alcanivo-rax borkumensis SK2 показал, что ген alkBl ответствен за деградацию короткоцепочечных н-алканов (н-гексана) [8]. Мутантный штамм A. borkumensis SK2, дефектный одновременно по генам alkBl и alkB2, сохраняет способность расти на среднеце-почечных н-алканах; это свидетельствует о том, что гены, отличные от alkBl и alkB2, также вовлечены в гидроксилирование н-алканов.
К началу нашей работы в генетическом банке имелись лишь две небольшие последовательности фрагментов alkB-генов термофильных бактерий Geobacillus thermoleovorans штамм 70 и G. thermo-glucosidasius штамм TR2 [9, 10]. Нами и другими авторами показано, что спорообразующие бактерии рода Geobacillus (G. subterraneus, G. stearothermo-philus, G. uzenensis, G. thermoglucosidasius, G. thermoleovorans и G. jurassicus) - обычные обитатели высокотемпературных нефтяных пластов и неф-тесодержащих пород [11-16]. В ряде публикаций сообщалось о способности геобацилл использо-
вать насыщенные и ароматические углеводороды и нефть [17-22].
Целью настоящей статьи был поиск и сравнительная характеристика генов алкан-гидроксила-зы у 11 штаммов термофильных аэробных неф-теокисляющих бактерий рода Geobacillus.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы. В работе использовали 8 штаммов рода Geobacillus [G. uzenensis UT (DSM 13551T = VKM B-2229T) и X (VKM B-2228); G. subterraneus 34T (DSM 13552T= VKM B-2226T); G. gargensis GaT (DSM 15378T = VKM B-2300T); G. jurassicus DS1T (DSM 15726T = VKM B-2301T); G. thermoleovorans vw3-1n; G. toebii B1024 и G. thermoglucosidasius 3Feng], выделенных из высокотемпературных нефтяных пластов и из горячих источников сотрудниками ИНМИ РАН [11, 14, 15]. Три штамма получены из германской (G. stearothermophilus DSM 22T и G. thermoleovorans DSM 5366T) и всероссийской (G. thermocatenulatus VKM B-1259T) коллекций микроорганизмов. Штаммы поддерживали на богатой плотной среде (Plate Count Agar, "Sigma", США) и на жидкой минеральной среде со смесью н-алканов C10-C20 или сырой нефтью (0.5-2%, объем/объем). В состав минеральной среды входили (г л-1 дистиллированной воды): KH2PO4, 0.75; K2HPO4, 1.5; NH4Cl, 1.0; CaCl2 x 2H2O, 0.02; NaCl, 5.0; MgSO4 x 7H2O, 0.2; KCl, 0.1.
Выделение ДНК и амплификация. Штаммы выращивали в жидкой среде со смесью н-алканов C10-C20 в стационарном режиме при 60°C в течение 3-7 суток. Биомассу концентрировали на центрифуге Beckman JA10 при 8 тыс. об/мин в течение 1 ч. ДНК выделяли из биомассы с использованием набора "DiatomtmDNAprep" ("Биоком", Россия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя с небольшими модификациями. Очищенный препарат ДНК растворяли в 100 мкл бидистиллята и использовали в качестве матрицы для проведения поли-меразной цепной реакции.
Для амплификации фрагментов генов alkB использовали вырожденные олигонуклеотидные праймеры: прямой Alk-BFB (5'-GGT ACG GSC AYT TCT ACR TCG A-3') и обратный Alk-BRB (5'-CGG RTT CGC GTG RTG RT-3'). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 10-50 нг матрицы ДНК, праймеры в концентрации 5 пмоль, dNTP (200 мкМ каждого), 0.5 ед. термостабильной ДНК Taq-поли-меразы, однократный Taq-буфер, содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl и 2 мМ MgCl2.
ГОМОЛОГИ ГЕНА AlkB ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 5'-1206 п.н.-З'
I
478 п.н.
Alk-BFB Alk-BRB
I
I
485
• I ■ ■
I
495
- I • ■
Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 Rhodococcus sp. Q15 Prauseella rugosa Q15 Pseudomonas putida GPo1
tcTACGGcCAtTTCTACgTCGA ctTACGGtCAcTTCTACcTCGA tcTACGGgCAcTTCTACaTCGA ggTACGGtCAcTTCTtTaTtGA
I
945
-I - -
I
955
• I
Последовательности праймеров ' ggtacggscayttctacrtcga '
AcCAtCACGCGAAtCCG AtCAcCAtGCGAAtCCG AtCAcCACGCGAAcCCG AtCAcCACGCGcAtCCa
AYCAYCACGCGAAYCCG 3'-TRGTRGTGCGCTTRGGC-5'
Рис. 1. Конструкции праймеров для амплификации фрагментов генов алкан-монооксигеназ у представителей рода Geobacillus. Расположение праймерных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.