ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.252.59
ГОМОЛОГИ ГЕНА ПЕРИПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА ЛИЗОЦИМА PliC И ИХ РОЛЬ В АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ © 2014 г. С. В. Андрющенко*, 1, Н. Б. Перунова*, О. В. Бухарин*
*Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург Поступила в редакцию 28.05.2013 г.
У энтеробактерий известно два семейства специфических секретируемых ингибиторов лизоцима типа C, выделяемых из периплазматического пространства: Ivy и PliC. Способность микроорганизмов к дистантной инактивации лизоцима (антилизоцимная активность) максимально проявляется у штаммов и видов, несущих гомологи генаpliC. Показано, что гомолог генаpliC, локализованный в мегаплазмиде Klebsiella pneumoniae длиной около 200 т.п.н., значительно отличается по аминокислотному составу кодируемого полипептида. В то же время, как и гомолог гена pliC Salmonella enterica, он имеет отщепляемую сигнальную часть и содержит идентичные функционально-критичные аминокислоты активного центра ингибитора. Антилизоцимная активность pliC-положительных штаммов K. pneumoniae выявлялась на уровне, соответствующем максимальным значениям, установленным уpliC-позитивных бактерий вида S. enterica. Отмечено, что высокий уровень антилизо-цимной активности штаммов K. pneumoniae, содержащих плазмидный гомолог гена pliC, наблюдался у всех исследованных штаммов, в отличие от представителей вида S. enterica, несущих известный хромосомный гомолог гена pliC.
Ключевые слова: лизоцим, лизоцимрезистентность, антилизоцимная активность, ген pliC, плазми-ды, энтеробактерии, персистенция бактерий.
DOI: 10.7868/S0026365614030045
Со времен открытия лизоцима А. Флемингом прошло уже более 80 лет, на протяжении которых этот белок играл важнейшую роль как модельный фермент во многих разделах современной биологии, включая химию белка, кристаллографию, ЯМР, энзимологию и иммунологию. Установлена биологическая роль лизоцима как универсального фактора защиты млекопитающих и многих других позвоночных от внедрения микробных патогенов, а устойчивость к лизоциму у микроорганизмов различных таксономических групп, определяемая как лизоцимрезистентность, показана в качестве одного из важнейших условий выживания (персистенции) бактерий в организме хозяина [1]. С другой стороны, форма взаимодействия бактерий с лизоцимом, фенотипически выявляемая как фактор, экскретируемый бактериальными клетками во внеклеточную среду, была названа антилизоцимной активностью [2]. Решение вопроса о связи этих механизмов взаимодействия бактерий с лизоцимом (лизоцимрезистентности и антилизоцимной активности) стало возможно с развитием молекулярно-генетических методов
1 Автор для корреспонденции (e-mail: rattus000@gmail.com).
исследования и открытия первого специфичного белка-ингибитора лизоцима позвоночных, названного Ivy [3].
В настоящее время известно два семейства ингибиторов лизоцима, секретируемый характер которых делает их одними из вероятных кандидатов на место фактора антилизоцимной активности: IvyC (Inhibitor of vertebrate lysozyme type C — ингибитор лизоцима позвоночных типа C) [4] и PliC/MliC (periplasmic/membrane lysozyme inhibitor type C — периплазматический/мембраносвязан-ный ингибитор лизоцима типа C) [1]. Причем молекулярная масса белка PliC, описанного в качестве фактора устойчивости к лизоциму самой клетки-продуцента, после отщепления сигнального пептида составляет менее 10 кДа. Это в 1.5 раза меньше, чем у белка IvyC, что предполагает не только его секрецию в периплазматическое пространство, но и большую вероятность выхода за пределы микробной клетки.
Генетические исследования показали, что гены лизоцимрезистентности, кодирующие ингибиторы лизоцима IvyC и PliC, преимущественно встречаются в хромосоме и распространены среди многих родов энтеробактерий [1, 4], за исклю-
чением патогенных вариантов Klebsiella pneumoniae, у которых обнаружен фрагмент нуклеотидных последовательностей мегаплазмид вирулентности, аннотированный как гомолог гена периплаз-матического ингибитора лизоцимаpliC [5, 6]. Что же касается поиска детерминант антилизоцим-ной активности, то на настоящий момент описана только их плазмидная локализация, при этом структура и механизм действия кодируемых ими белков остаются неизученными [7, 8]. Кроме того, отсутствуют данные о вкладе в общий уровень секреторной антилизоцимной активности хромосомных детерминант ингибиторов лизоцима.
Целью нашей работы стало определение связи генетических детерминант периплазматического ингибитора лизоцима С (pliC) с фенотипическим проявлением антилизоцимной активности энте-робактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования служили 50 штаммов энтеробактерий: 29 штаммов Salmonella enterica, сероваров Enteritidis и Typhimurium (музейные культуры ИКВС УрО РАН), S. enterica серовар Typhimurium ATCC 14028, 19 штаммов Klebsiella pneumoniae (музейные культуры ИКВС УрО РАН), K. pneumoniae ГИСК 278, изогенные клоны E. coli K-12 MG1655 — исходный бесплаз-мидный вариант и два трансформанта, содержащих векторы pBlue Script либо pCambia 1301, штамм E. coli XL1-Blue, использованные в качестве отрицательных контролей при исследовании генотипических и фенотипических параметров. Для исследования фенотипического проявления антилизоцимной активности использовали тестерный штамм Micrococcus luteus NCTC 2665.
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Набор нуклеотидных последовательностей для анализа производили в базе данных RefSeq ("National Library of Medicine", США). Для внутри- и межродового филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гомологов изучаемого гена и предполагаемых продуктов их трансляции, выравниваемых по методу ClustalW [9] и графического представления полученных результатов, а также автоматизированного подбора праймерных пар для последующего выявления интересующих генетических детерминант методом ПЦР, был применен пакет программного обеспечения Lasergene 7.1 ("DNASTAR, Inc.", США).
Определение секретируемого характера предполагаемого продукта трансляции плазмидного гомолога pliC произведено с помощью сервиса SignalP 4.0 для грамотрицательных бактерий как с учетом, так и без учета возможного наличия трансмембранных регионов [10].
Верификация специфичности полученных олигонуклеотидов производилась с помощью сервиса Standard Nucleotide BLAST ("National Library of Medicine", США).
В работе с целью выявления гомологов изучаемых генов были использованы праймеры последовательностей: F: 5' -TGATCCCATTTACCCTC -TTTCTCG-3' и R: 5'-TCAGCCGTTTTGCCT-TTGGTAT-3' - для pliC+ ¿l enterica; F: 5'-CCTC-TATCGTTCTGCTTGCTTTGA-3' и R: 5'-TGCT-CAGGATGTCTTCGTTCTTTT-3' - для pliC+-плазмиды вирулентности K. pneumoniae.
ПЦР-скрининг наличия гомологов pliC. Выделение матричной ДНК для амплификации проводили путем суспендирования 1-2 мг бактериальной массы чистой культуры каждого исследуемого штамма в 0.1 мл смеси реагентов ДНК-Экспресс (НПФ "Литех", Россия) с последующим нагреванием до температуры 98°С в течение 20 мин в программируемом твердотельном термостате Терцик МС-2 ("ДНК-технология", Россия), после чего образец центрифугировали в микроцентрифуге 5415D ("Eppendorf", Германия) при 16100 g в течение 0.5 мин при комнатной температуре. Полученный супернатант вносили в предварительно подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл.
Реакционную смесь для ПЦР в объеме 15 мкл готовили из набора праймеров и реагентов ООО "Синтол" в составе: 2 мкл 25 мМ раствора магния хлорида; 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Б;
1.6 мкл 2.5 мМ раствора дезоксирибонуклеоти-дтрифосфатов, 0.5 мкл 10 мкМ смеси праймеров, 0.2 мкл 5 ед/мкл раствора 7й#-полимеразы и
8.7 мкл деионизованной воды. На поверхность реакционной смеси наслаивали 20-30 мкл стерильного парафинового масла. Реакцию проводили в прогретом до 93°C ДНК-амплификаторе "Терцик МС-2" в режиме активного регулирования температуры по алгоритму: 1 цикл предварительного прогрева при 93°C в течение 0.5 мин; 30 циклов амплификации при режиме: денатурация — 93°C, 10 с; отжиг — 60°C, 10 с; элонгация — 72°C, 10 с; и 1 цикл заключительной элонгации при 72°C в течение 2 мин для вышеуказанных праймеров к гомологам гена pliC [11].
Получаемые ампликоны c длиной 274 п.н. для pliC+ S. enterica и 288 п.н. для pliC+-мегаплазмиды K. pneumoniae подвергали агарозному гель-электрофорезу [12]. С этой целью весь объем пробы, содержащей амплифицированную ДНК, вносили в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводили в TBE-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида при напряжении поля 10 B/см в течение 18 мин. Визуализацию результатов разделения нуклеиновых кислот проводили в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной
волны 312 нм на установке гель-фотодокументирования "Vilber Lourmat".
В качестве маркера молекулярной массы нуклеиновых кислот использовали линейный маркер 100bp (ООО "Лаборатория Медиген", Россия) в количестве 1.5 мкг.
Регистрацию результатов проводили на основе анализа полос люминесценции в агарозном геле, расположенных в диапазоне молекулярных масс, соответствующих локализации маркерных фрагментов от 200 до 300 п.н.
С целью контроля специфичности ПЦР-ана-лиза были использованы образцы матричной ДНК, выделенные из клеток модельных штаммов E. coli K-12 MG1655 и E. coliXL1-Blue.
Определение антилизоцимной активности энте-робактерий. У всех исследуемых штаммов энте-робактерий определяли уровень антилизоцимной активности (АЛА) чашечным методом, описанным О.В. Бухариным [2], в диапазоне концентраций вносимого лизоцима от 0 до 6 мкг/мл с шагом 1 мкг/мл. За уровень антилизоцимной активности исследуемых культур принимали максимальное значение концентрации лизоцима в среде, выраженной в мкг/мл, при которой еще наблюдался рост микрококка.
Для подтверждения секретируемого характера антилизоцимной активности, выявляемой чашечным методом, применяли методы фотометрического определения уровня АЛА как в супер-натанте по О.В. Бухарину [2], так и уровня сорбции лизоцима бактериальными клетками методом В.Ю. Соколова и А.П. Луда в модификации Черкасов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.