научная статья по теме ГОРМОНАЛЬНАЯ ИНДУКЦИЯ СОЗРЕВАНИЯ И ОВУЛЯЦИИ IN VITRO ООЦИТОВ ВЬЮНА И ПОЛУЧЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОК, СПОСОБНЫХ К ОПЛОДОТВОРЕНИЮ И РАЗВИТИЮ Биология

Текст научной статьи на тему «ГОРМОНАЛЬНАЯ ИНДУКЦИЯ СОЗРЕВАНИЯ И ОВУЛЯЦИИ IN VITRO ООЦИТОВ ВЬЮНА И ПОЛУЧЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОК, СПОСОБНЫХ К ОПЛОДОТВОРЕНИЮ И РАЗВИТИЮ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 3, с. 198-206

= ГАМЕТОГЕНЕЗ -

УДК 591.3:597.5

ГОРМОНАЛЬНАЯ ИНДУКЦИЯ СОЗРЕВАНИЯ И ОВУЛЯЦИИ IN VITRO ООЦИТОВ ВЬЮНА И ПОЛУЧЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОК, СПОСОБНЫХ К ОПЛОДОТВОРЕНИЮ И РАЗВИТИЮ

© 2015 г. М. Н. Скоблина, А. А. Минин

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26

E-mail: skoblina38@mail.ru Поступила в редакцию 20.10.2014 г.

Окончательный вариант получен 30.12.2014 г.

Достигшие дефинитивного размера ооциты вьюна, окруженные фолликулярными оболочками, под влиянием 1 мкг/мл прогестерона способны созревать и овулировать в 75% среде Лейбовитца с 1 г/л бикарбоната натрия или с рН, доведенным до 9.0 1 N едким натром. При добавлении в среду инкубации 20% сыворотки крупного рогатого скота осемененные яйца развиваются до стадии сформированной предличинки. Замена сыворотки крупного рогатого скота 10—20% полостной жидкостью вьюна или 20% полостной жидкостью карпа обеспечивает более полноценное развитие осемененных яиц до стадии предличинок, переходящих на активное питание.

Ключевые слова: фолликулы, ооциты, прогестерон, полостная жидкость, созревание, овуляция, переход предличинок на активное питание, вьюн Misgurnus

DOI: 10.7868/S0475145015030076

ВВЕДЕНИЕ

Если ооциты костистых рыб, созревшие и ову-лировавшие в результате гормональной обработки in vitro, после оплодотворения развиваются до стадии вылупления предличинок, способных перейти на активное питание, значит условия, в которых они созревали и овулировали близки к таковым in vivo. Создается возможность для воспроизведения и изучения механизмов процессов, происходящих в ооцитах в теле самки. Понятно, поэтому, как важно знать эти условия.

Созревание ооцитов костистых рыб in vitro хорошо исследовано и было воспроизведено у многих видов (Nagahama, Yamashita, 2008). Овуляцию их ооцитов in vitro удается получить значительно реже (Скоблина, 2009), а способность ооцитов, овулировавших вне тела самки, к развитию после оплодотворения до более или менее продвинутых стадий до сих пор удалось получить только у четырех видов рыб: вьюна (Misgurnus fossilis) (Саат, 1980, 1982, 1985), карпа (Cyprinus carpio) (Epler, 1981; Саат, 1988), медаки (Oryzias latipes) (Ogiwara et al., 2013) и японского угря (Anguilla japonica) (Abe et al., 2010). Во всех этих работах фолликулы были взяты на стадии, когда в отсутствие гормональной обработки ооциты не созревают и не овулируют in vitro.

Достигшие дефинитивного размера ооциты вьюна в среде 199 с 20% сывороткой крупного ро-

гатого скота (СКРС) под влиянием прогестерона и хориогонина созревали и овулировали в высоком проценте случаев, а после осеменения начинали дробиться (Саат, 1980). Они оказались способны к развитию до стадии образования сомитов (Саат, 1982). Упоминается, что единичные зародыши достигали стадии вылупления (Саат, 1985). Невысокий процент вылупившихся предличинок получен и после осеменения овулировавших in vitro ооцитов карпа, но у этого вида овуляцию ооцитов удавалось получить, только добавляя в среду простагландин F2a (Саат, 1988). В работе Фужимори с соавторами (Fujimori et al., 2011) показано, что самые крупные ооциты медаки в 90% среде 199 (рН 7.4) овулировали под влиянием ре-комбинантного Л Г медаки и после осеменения развивались только до стадии бластулы (Ogiwara et al., 2013). Завершившие вителлогенез ооциты японского угря в среде Кортланда с 0.5—1% ВСА созревали под влиянием 17а, 20Р-ДГП, овулиро-вали под влиянием простагландина F2a и после осеменения зародыши в небольшом проценте случаев достигали стадии вылупления, но предличинки погибали, не переходя на активное питание (Abe et al., 2010).

Кроме того, что для овуляции in vitro ооцитов костистых рыб в некоторых случаях приходится создавать специальные условия, отличные от условий созревания, успешному развитию их за-

родышей препятствует спонтанная активация, происходящая при попадании овулировавших ооцитов в среду инкубации и делающая невозможным их оплодотворение (Минин, Озерова, 2008). Необходимо отметить, однако, что хотя спонтанная активация характерна для яиц большинства костистых рыб, у разных видов она происходит через разное время после овуляции (Гинзбург, 1968). Поэтому в некоторых случаях овули-ровавшие ооциты могут быть оплодотворены без создания для этого специальных условий, препятствующих активации (Abe et al., 2010; Ogiwara et al., 2013). Активация овулировавших in vivo ооцитов вьюна происходит приблизительно в течение 10 мин после их перенесения в водные растворы различного солевого состава (Минин, Озерова, 2008), что, учитывая асинхронность овуляции ооцитов, не позволяет получить оплодотворение сколько-нибудь значительного количества яиц, не подавляя их спонтанную активацию.

Известно, что спонтанную активацию яиц вьюна могут подавлять ингибиторы протеаз (Минин и Озерова, 2008). Показано также, что различные ингибиторы протеаз присутствуют в сыворотке крови (Knoll-Gellida et al., 2006) и в полостной жидкости рыб (Coffman, Goetz, 1998; Минин, Озерова, 2008). Добавление сыворотки крови или полостной жидкости в среду культивирования препятствует активации ооцитов и делает возможным их оплодотворение (Corley-Smith et al., 2006; Минин, Озерова, 2008).

Задачей настоящей работы было попытаться найти условия инкубации и гормональной обработки фолликулов вьюна, которые обеспечивают эффективность созревания и овуляции ооцитов in vitro на фоне предотвращения спонтанной активации ооцитов. Оценивалось количество созревших и овулировавших ооцитов, которые могут нормально развиваться после оплодотворения до стадии вы-лупления и далее до конечной стадии, на которой мы проводили оценку результатов, — перехода пред-личинок на активное питание.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проведены в мае 2012 г., в январе—мае 2013 г. и в марте—апреле 2014 г. на фолликулах (окруженных фолликулярными оболочками ооцитах) 16 самок вьюна. Отловленных поздней осенью и в начале зимы самок и самцов содержали отдельно в аквариумах с отстоянной водой в холодильнике при 4°C. Размеры самок составляли от 17 до 22 см. Яичники извлекали из самок, анестезированных 0.2% MS-222 ("Sigma") и переносили в охлажденную до 4°C 75% среду Лейбо-витца (Л75).

Каждый яичник разделяли отточенными пинцетами на 8—12 частей в зависимости от его размера и помещали в холодильник. Одну часть переносили в чашку Петри с 10 мл Л75 без бикарбоната

натрия и разделяли на фрагменты, содержащие 5— 15 фолликулов. Так постепенно разделяли оба яичника, и все фолликулы собирали в чашке Петри с 9 мл среды. Из этой чашки часть фрагментов переносили в другую такую же с охлажденной средой, под бинокуляром отсчитывали обычно по 100—150 фолликулов и переносили их в чашки Петри с 5 мл среды. Чашки опять ставили в холодильник. Среду в чашке, где считали фолликулы, меняли на охлажденную каждые 10 мин. После того, как в холодильнике накапливалось число чашек, необходимое для конкретного опыта, их одновременно переносили в термостат с 16—17°C. В это время фолликулы переносили в среды, влияние которых исследовали в опыте.

Мы использовали несколько сред инкубации: среду 199, среду Л75 (рН 7.7), (исходную среду Лейбовитца разводили водой 3 : 1), среду Л75 с 1 г/л NaHCO3 (рН 7.8) (Л75б), среду Л75 с рН, до-веденым до 9 добавлением 1 N раствора NaOH (Л75, рН 9), 90% среду Лейбовитца (Л90, рН 7.7) (Л90), среду Л90 с 1 г/л NaHCO3 (рН 7.8) (Л90б), среду Л90 с рН, доведеным 1 N раствором NaOH до 9.0 (Л90, рН 9). Кроме того, в среды добавляли либо 20% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), либо 10 или 20% полостной жидкости (ПЖ) вьюна или 20% ПЖ карпа, а к среде Л75 с бикарбонатом натрия еще и фетальную сыворотку. рН сред измеряли после добавления в них СКРС или ПЖ. Во все среды добавляли гентами-цин (100 мкг/мл).

Для стимуляции созревания и овуляции использовали прогестерон (П) (Sigma) и в некоторых опытах хорионический гонадотропин человека (ХГ) (Московский эндокринный завод). Прогестерон использовали в концентрации 1 мкг/мл. ХГ использовали в концентрации 25 МЕ/мл. Гормональные препараты добавляли непосредственно перед помещением чашек с фолликулами в термостат. СКРС (ПанЭко), ПЖ вьюна (10-20%) или карпа (20%) обычно добавляли через 30 мин после гормональных препаратов. Изменение времени их внесения отмечено в результатах. Приготовление полостной жидкости вьюна описано ранее (Минин, Озерова, 2008).

Просмотр чашек для определения начала овуляции обычно начинали через 12-15 ч после начала опыта. Овулировавшие in vitro ооциты переносили в чашки Петри с 7.5 мл той же среды, в которой они овулировали, пипеткой отсасывали среду инкубации и осеменяли (Костомарова, Нейфах, 1964). Осеменение проводили в несколько приемов. Первое осеменение — через 1-2 ч после появления первых овулировавших ооцитов, а затем обычно с интервалом в 2 ч. Последнее осеменение в первых опытах проводили через 48 ч после начала гормональной обработки, но в дальнейшем не позже, чем через сутки. Через 2.5-3 ч осемененные ооциты просматривали и удаляли неоплодотворенные (побелевшие) яйца, осталь-

Плавающие инкубаторы в аквариуме с продувкой.

ные переносили в чашку Петри с 9 мл воды и ставили в термостат (t = 16—17°C). Воду в чашках меняли 2—3 раза в сутки, одновременно удаляя погибших зародышей. В первых опытах все развитие проходило в условиях стационарной культуры — в чашках Петри в термостате. В дальнейшем яйца, обычно на стадии гаструляции, переносили в плавающие инкубаторы и помещали их в аквариум с продувкой (рисунок). Это позволяло не менять воду в процессе инкубации яиц. Результаты опытов учитывали на стадии дробления (чаще всего на стадии 4 бластомеров, но иногда и на более поздних стадиях дробления), стадии завершения обрастания, стадии сформировавшейся пред-личинки и стадии вылупления. В таблицы включено только число вылупившихся нормально развитых предличинок, вылупившихся уродливых — не учитывали. Вылупившихся предличинок четырех самок через 5—7 дней после вылупления переносили в разные камеры с продувкой и кормили декапсулированными яйцами артемии. О начале активного питания судили по поя

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»