научная статья по теме Гормоноподобные свойства синтетического декапептида, соответствующего адренокортикотропинподобной последовательности иммуноглобулина G1 человека Химия

Текст научной статьи на тему «Гормоноподобные свойства синтетического декапептида, соответствующего адренокортикотропинподобной последовательности иммуноглобулина G1 человека»

w

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2000, том 26, № 1, с. 31-38

УДК 577.112.384.4.01.7

ГОРМОНОПОДОБНЫЕ СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКОГО ДЕКА ПЕПТИДА, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО АДРЕНОКОРТИКОТРОПИНПОДОБНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНА Gl ЧЕЛОВЕКА

© 2000 г. Е. В. Наволоцкая#, Т. А. Заргарова, Т. Н. Лепихова, В. JI. Туробов, Р. И. Нуриева, Н. В. Малкова, В. П. Завьялов*, В. М. Липкин

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142292,

Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6; * Институт инженерной иммунологии, 142380, Московская обл., Чеховский район, нос. Любучаны Поступила в редакцию 26.03.99 г. Принята к печати 20.09.99 г.

Изучено антипролиферативное и иммуносупрессорное действие in vitro синтетического адренокор-тикотропин(АКТГ)-подобного декапептида H-Val-Lys-Lys-Pro-GIy-Ser-Ser-Val-Lys-Val-OH (авторское название пептида - иммунокортин), соответствующего фрагменту аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжелой цепи IgG 1 человека. Иммунокортин в концентрациях 10-"-Ю-7 М ингибирует рост клеток человеческой лимфобластной линии МТ-4, подавляет бласт-ную трансформацию тимоцитов, снижает спонтанную подвижность неритонеальных макрофагов и их бактерицидность по отношению к бактериям вирулентного штамма Salmonella typh.imu.rium 415. С помощью 1251-меченого "адресного" фрагмента АКТГ-[|251]АКТГ-(13-24) показано, что клетки МТ-4 экспрессируют специфические рецепторы АКТГ (Kd 97 пМ). Иммунокортин и АКТГ человека в отличие от тяжелой цепи IgG 1 конкурентно ингибировали связывание [1251]АКТГ-( 13-24) с этими рецепторами (К[{ 0.38, К,2 0.34 нМ соответственно). Обнаружены и охарактеризованы специфические рецепторы АКТГ (Äj 5.8 нМ) fjst тимоцитах мыши. Показано, что немеченый иммунокортин конкурирует с меченым АКТГ-(13-24) за связывание с этими рецепторами (Kl 1.8 нМ). Установлено, что связывание иммунокортина с рецепторами на тимоцитах приводит к активации аденилатцикла-зы этих клеток и увеличению внутриклеточного содержания сАМР.

Ключевые слова: адренокортикотропин (АКТГ); IgG; пептиды; рецепторы; MT-4-клетки; им-мунекомпетентные клетки.

ВВЕДЕНИЕ

В начале 80-х годов сотрудники калифорнийского Института биологических исследований [1], пытаясь выделить из экстракта плаценты человека адренокортикотропный гормон (АКТГ) и Р-эндор-фин, использовали для этой цели в качестве аффинных сорбентов иммобилизованные антитела к данным гормонам. При этом ими был выделен полипептид с молекулярной массой 50 кДа, который был идентичен тяжелой (Н) цепи IgG. Работа по выяснению причин такого эффекта привела к обнаружению в Н-цепи последовательностей, гомологичных АКТГ и (3-зндорфину. Фрагмент 364—377 константной части Н-цепи IgG (SLTCLVKGFYPSDI) имеет 40% гомологии с антигенной детерминан-той Р-эндорфина (KSQTPLVTLFKNALKN), а фрагмент 9-22 вариабельной части Н-цепи IgG I (AEVKKPGSSVKVSC) на 36% гомологичен

# Автор для переписки (тел.: (27)73-08-93; факс: (0967) 79-05-27; e-mail: navolots@fibkh.scrpukhov.su).

АКТГ-(11-24) (КРVGKKRRPVKVYP). Американские исследователи синтезировали четырнадца-тичленный пептид, соответствующий Р-эндорфин-подобной последовательности IgG, и установили способность этого пептида взаимодействовать с опиатными рецепторами головного мозга крысы [2].

Ранее мы синтезировали АКТГ-подобный дека-пептид (H-VKKPGSSVKV-OH), соответствующий фрагменту аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части Н-цепи IgG 1 человека (авторское название пептида - иммунокортин) и показали, что этот пептид способен с высоким сродством связываться с рецепторами АКТГ и активировать аденилатциклазу синаптических мембран головного мозга мыши [3]. Цель настоящей работы - изучение влияния иммунокортина in vitro на клетки человеческой лимфобластной линии МТ-4 и мышиные тимоциты и макрофаги. Параллельно с иммунокортином был изучен синтетический пептид АКТГ-( 13-24) (H-Val-Gly-Lys-

lg([Пептид], М)

Рис. 1. Влияние иммунокортипа (/), АКТГ человека (2), АКТГ-( 13-24) (3) и тяжелой цепи IgGl человека (4) на рост клеток МТ-4 in vitro.

Рис. 2. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [1251] АКТГ-( 13-24) с клетками МТ-4. В и /г- молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно.

Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH), подобный по структуре "адресной" части АКТГ, ответственной за связывание гормона с рецептором, но не обладающей биологической активностью [4]. Ранее показано, что при инкубации с синаптичес-кими мембранами головного мозга АКТГ-( 13-24) также демонстрировал высокоаффинное связывание (ATd 2.2 нМ), не приводящее к изменению аденилатцнклазной активности [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние иммунокортипа на рост клеток человеческой лимфобластной линии МТ-4 in vitro

На рис. 1 представлены результаты изучения влияния иммунокортина на рост клеток МТ-4. Параллельно были протестированы АКТГ человека, АКТГ-(13-24) и тяжелая цепь IgGl человека. Видно, что иммунокортин и АКТГ в широком диапазоне концентраций (10~ш-10~7 М) ингибиру-ют включение [3Н-метил]тимидина клетками МТ-4. Активность АКТГ-( 13-24) и тяжелой цепи IgGl была очень низкой (не более 10% контрольного уровня).

Ранее нами показано, что иммунокортин конкурирует с "адресным" меченым фрагментом АКТГ-[1251] АКТГ-( 13-24) за связывание с рецепторами АКТГ на синаптических мембранах головного мозга мыши {Kt 0.9 нМ) [3]. В настоящей работе с помощью [ш1]АКТГ-( 13-24) впервые обнаружены и охарактеризованы специфические рецепторы АКТГ на клетках МТ-4. На рис. 2 приведен график Скэтчарда, характеризующий специфическое связывание [|251]АКТГ-(13-24) с клетками МТ-4: Кй 97 пМ, п = 2 х 106 сайтов связывания в расчете на одну клетку.

С целью выяснения специфичности выявленных рецепторов было изучено ингибирование связывания [|251]АКТГ-( 13-24) с клетками МТ-4 немечеными иммунокортином, АКТГ и тяжелой цепью Кривые ингибирования, приведен-

ные на рис. 3, свидетельствуют о том, что способностью ингибировать специфическое связывание меченого АКТГ-(13-24) обладают иммунокортин (К-, 0.38 нМ) и АКТГ {К, 0.34 нМ). Тяжелая цепь даже при высоких концентрациях практически не ингибировала связывание. Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы: 1) иммунокортин с высоким сродством связывается с рецепторами АКТГ на клетках МТ-4; 2) тяжелая цепь ^01, содержащая последовательность иммунокортина, не способна к связыванию с этими рецепторами. Кроме того, специфичность и высокая аффинность связывания иммунокортина и АКТГ с рецепторами на клетках МТ-4

^([Немеченый лиганд], М)

Рис. 3. Ингибирование специфического связывания 1 нМ [|251]АКТГ-(13-24) немечеными иммунокортином (У). АКТГ человека (2) и тяжелой цепью ^О1 человека (:>).

Таблица 1. Влияние иммунокортина на взаимодействие перитонеальных макрофагов мыши с бактериями вирулентного штамма 5. гурЫтипшп 415*

Концентрация пептида, М Время фагоцитоза, ч ФА (% ± SEM) ЦПД (% ± SEM) ФЧ (п ± SEM)

- 1 65.33 ± 1.11 1.33 ±0.27 3.90 ±0.13

2 72.67 ± 1.07 13.67 + 0.69 10.17 ±0.18

4 72.33 ± 1.29 25.67 ± 1.41 11.17 ± 1.03

7 29.00 ±0.89 66.67 ± 0.62 15.50 ±0.34

5 х Ю-6 1 49.50 + 0.85 47.75 ± 1.72 7.25 ± 0.27

2 0 100 -

5 х 10"7 1 32.75 ±0.72 66.50 ±0.18 6.38 ±0.19

2 15.75 ±0.56 84.25 ±0.56 14.80 ±0.33

4 0 100 -

5 х 10"8 1 78.50 ±0.57 21.50 ±0.57 5.88 ±0.06

2 70.75 ± 0.76 29.00 ±0.85 6.15 + 0.06

4 44.00 ±0.81 56.00 ±0.81 8.90 ± 0.10

7 0 100 -

* ФА - фагоцитарная активность; ЦПД - цитопатичсскос действие бактерий; ФЧ - фагоцитарное число.

позволяет предположить, что их антипролифера-тивное действие на эти клетки опосредовано через рецепторы АКТГ.

Известно, что МТ-4 чувствительны к действию а/р-интерферонов (IFN-а/Р). IFN-a/p способны ингибировать рост клеток МТ-4 щ vitro и in vivo, при этом у клеток МТ-4 присутствуют специфические рецепторы IFN-a/p (Kd ~ 10 8 М) [4]. Недавно синтезированы пептиды - фрагменты IFN-a2 человека, способные при концентрациях 10"7-10~5 М ингибировать рост клеток МТ-4 и специфически связываться с рецепторами IFN-a/P [5]. В этой связи следует отметить, что активность иммунокортина по отношению к клеткам МТ-4 много выше, чем у IFN-a/p и фрагментов IFN-a2.

без него (контроль). Фагоцитарная активность (ФА) - число макрофагов (%), участвующих в фагоцитозе; цитопатическое действие бактерий (ЦПД) - число фагоцитов (%), разрушенных внутриклеточными бактериями; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число микробов, приходящееся на один макрофаг.

Видно, что в присутствии иммунокортина в концентрации 5 х Ю-6 М полное разрушение фагоцитов внутриклеточными сальмонеллами наблюдалось через 2 ч фагоцитоза. При концентрации пептида в среде 5 х 10 7 М монослой макрофагов был разрушен через 4 ч, а при концентрации 5 х 10~8 М - через 7 ч с момента инфицирования.

Влияние иммунокортина на активность имму но компетентных клеток мыши in vitro

Полученные нами результаты показали, что иммунокортин в диапазоне концентраций 3.5 х х Ю"7-10~5 М подавляет бласт-трансформацию тимоцитов, индуцированную конканавалином А (рис. 4). Супрессорный эффект пептида не был связан с его цитотоксическим действием: жизнеспособность клеток по тесту с трипановым синим сохранялась на уровне 95-97%.

Иммунокортин подавлял бактерицидную активность перитонеальных макрофагов при фагоцитозе бактерий Salmonella typhimurium 415 in vitro. В табл. 1 приведены значения основных показателей фагоцитоза (ФА, ЦПД и ФЧ) при взаимодействии этих бактерий с макрофагами в присутствии пептида в разных концентрациях и

03 К к

и к S

К

д

4 я н

<и -£

о . я К <и

ч и m

20

15

10

ъ

гЪ

0.35 3.5 10 [Иммунокортин], М

35

Рис. 4. Влияние иммунокортина на индуцированную конканавалином А бластную трансформацию тимоцитов мыши. По оси абсцисс - молярная концентра-ция пептида; по оси ординат - включение [ Н-ме-тил |тимидина (имп/мин).

Таблица 2. Влияние иммунокортина и АКТГ-(13-24)-пептида на аденилатциклазную активность плазматических мембран тимоцитов и перитонеальных макрофагов мыши

Концентрация, М Аденилатциклазная активность (нмоль сАМР/мг белка за 10 мин)

иммунокортин АКТГ-

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком