РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 20-24
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЫ CD16 ИНТАКТНЫМИ NK-КЛЕТКАМИ
© 2014 г. С.В. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина, И.В. Некрасова, О.Л. Горбунова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014
Исследовали влияние гормонов репродукции (ХГ, Е3, лептин, грелин, кисспептин) на фенотипическое созревание интактных ЫК-клеток небеременных женщин. Установлено, что в концентрациях, соответствующих первой половине физиологически протекающей беременности, Е3 снижает, а кисспептин и грелин не влияют на активность ЫК-клеток, в то время как ХГ и лептин способствуют терминальной дифференцировке (экспрессия СШ6) этих клеток. В концентрациях, соответствующих второй половине беременности, Е3 и грелин не влияют на активность ЫК-клеток, кисспетин и лептин угнетают, а ХГ стимулирует фенотипической созревание ЫК-клеток. Таким образом, гормональная модуляция одной из молекул терминальной дифференцировки ЫК-клеток (СШ6) является одним из возможных механизмов формирования специфического изменения баланса С03"СШ6+/ С03"СШ6- клеток во время физиологически протекающей беременности.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин, эстриол, лептин, грелин, кисспептин, ЫК-клетки
ВВЕДЕНИЕ
Объяснение причин толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду является актуальной проблемой репродуктивной иммунологии, в рамках которой важнейшим направлением является анализ роли гормонов в регуляции иммунитета.
Известно, что основные репродуктивные гормоны — хорионический гонадотропин (ХГ) и эстрогены — играют важную роль в регуляции иммунитета при беременности [1]. Помимо этого исследования последних лет убедительно доказывают, что пептидные гормоны лептин и грелин — реципрокные регуляторы энергетического гомеостаза, также являются модуляторами репродуктивной и иммунной функций [2]. Одним из недавно открытых гормонов является кисспептин, который появляется в циркуляции преиму-
Адрес: 614081 Пермь, ул. Голева, 13, ФГБУ Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Ширшеву С.В. E-mail: shirshev@iegm.ru
щественно в период беременности и только в этот период способен оказывать влияние на клетки иммунной системы [3, 4].
Во время беременности важную роль во взаимоотношениях матери и плода играют ЫК-клетки. Известно, что ЫК-клетки лизи-руют не только клетки-мишени, инфицированные внутриклеточными патогенами и неоплазмы, а также клетки трофобласта [5]. В период ранней беременности ЫК-клетки являются доминантными среди лимфоидных клеток, локализованных в децидуальной оболочке [6]. Помимо реализации своих цито-токсических функций эти клетки, находясь непосредственно в тканях, участвуют в формировании и моделировании спиральных артерий, плацентации и регуляции инвазии трофобласта за счет секреции интерлейкина (1Ь)-8 и ряда других факторов [6]. ЫК-клет-ки потенцируют также индукцию Т-регу-ляторных лимфоцитов через интерферон (1РЫ)-у-зависимую активацию децидуальных СБ14 + -клеток, сопровождаемую повышением активности индоламин-2,3-диоксигеназы с последующим повышением уровня Ь-кину-
ренина и продукцией трансформирующего фактора роста-(TGF)-ß [7]. Именно TGF-ß, в свою очередь, способствует трансформации периферических С016 + СВ9-НК-клеток в децидуальные СБ16-СБ9+НК-клетки (uNK), способствующие формированию иммунной толерантности в период беременности [8].
NK-клетки с фенотипом CD16 + CD56 + являются наиболее зрелыми и обладают высокой цитолитической активностью [8], поскольку молекула CD 16 представляет собой низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (Fcy RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности, а также в индукции секреции цитокинов [9]. Следует отметить, что экспрессия CD16 ассоциирована с терминальной стадией дифференцировки NK-клеток и приобретением ими наибольшей цитолитической активности [8].
Целью работы являлась оценка влияния гормонов репродукции на экспрессию молекулы CD16 интактными NK-клетками.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали суспензию моно-нуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин в фолликулярной фазе менструального цикла (n = 8). Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3). Полученную суспензию (1 х 106 мл) после двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 мМ HEPES; 2 mM L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение суток при 37° С в условиях 5% СО2.
ХГ («Profasi», Италия) вносили в культуры в концентрациях, характерных для I и III триместров беременности (100 МЕ/мл и 10 МЕ/мл, соответственно) [10]. Эстриол (Е3) («Biomedicals Inc.», Германия) использовали в концентрациях 2 и 20 нг/мл, отражающих его уровни в крови в I и III триместрах беременности, соответственно [11]. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во II — III триместрах беременности, соответственно [12]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1,25 и 0,83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности [13]. Кисспептин (Кис-
спептин-54, Metastin, Synthetic, «Calbiochem», США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I и II — III триместрах беременности — 4,6 пМ/л и 9,6 пМ/л, соответственно [14].
После суточной инкубации с гормонами, оценивали фенотип лимфоцитов, определяя содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD16+ с использование моноклональных антител анти-CD3-FITC и анти-CD16-PE, согласно методике производителя антител (Beckman Coulter, США). Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре («Becton Dickinson», США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч инкубации с гормонами, составляла 95 — 98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). При учете результатов подсчитывали не менее 100 000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли. Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного i-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из рис. 1, ХГ, вне зависимости от концентрации, повышает количество CD16+ NK-клеток в культуре. Суточная инкубация клеточных культур с Е3 в концентрации, соответствующей I триместру беременности, напротив, статистически значимо снижает процент лимфоцитов, экспонирующих CD16. При этом в концентрации, характерной для III триместра беременности, гормон не влияет на исследуемый показатель. Лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, повышает процент CD16+ NK-клеток, тогда как в концентрации, сопоставимой со II — III триместром, гормон снижает содержание этих клеток. В отличие от него грелин, вне зависимости от используемых концентраций, не влияет на процент CD16+ NK-клеток. Кисспептин, аналогично лептину, достоверно понижает уровень CD 16+ NK-клеток только в концентрации, соответствующей II — III триместру беременности.
Таким образом, в первой половине физиологически протекающей беременности Е3
КГК-клетки (СБЗ-С016+), %
14 * *
12 10
8 6 4
2
0
а 4 В ч
¡3
о и 0) И
В V© И ^о
О ^ В оС
д д
ч е
о §
£ О
(Г) г<1
ч
о и
я §
О н2
(Т) см
и Й и
1=5 о Чш
т-Н С*">
и в и в
Я р я
|_1 <М [-1 с-
_Г 00
Рис. Влияние гормонов репродукции на фенотипическое созревание ЫК-клеток (п = 8). Примечание: *р < 0,05 относительно контроля.
угнетает, а ХГ и лептин усиливают терминальную дифференцировку ЫК-клеток при отсутствии эффектов со стороны кисспептина и грелина. Во второй половине беременности Е3 и грелин не влияют, а кисспетин и лептин угнетают формирование СБ16 + ЫК-клеток, при неизменной стимуляции ХГ фенотипиче-ского созревания киллеров.
ОБСУЖДЕНИЕ
Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить наиболее, с нашей точки зрения, важные моменты.
Во-первых, из всех гормонов только грелин не принимает участия в контроле за терминальной дифференцировкой ЫК-клеток.
Во-вторых, за исключением ХГ остальные гормоны оказывают влияние на экспрессию СБ16 в зависимости от потриместровой концентрации.
Угнетающее действие Е3 в отношении цитотоксических СБ3- СБ16 + клеток в I триместре, может быть обусловлено непосредственным влиянием гормона на процессы экспрессии молекулы СБ 16 или носит опосредованное действие. Так, известно, что низкие концентрации Е3 способны усиливать продукцию 1Ь-10 [15], который снижает функциональную активность ЫК-клеток [16].
Поскольку высокая концентрация гормона не влияет на дифференцировку СБ3-СБ16 + клеток, второй вариант кажется наиболее вероятным.
Для кисспептина, чья концентрация во второй половине беременности вдвое больше, угнетающее действие на терминальную дифференцировку ЫК-клеток, по-видимому, связано с его непосредственным эффектом на данный тип клеток [4]. Так, установлено, что при спонтанных абортах, связанных с увеличением ЫК-клеток, параллельно угнетается выработка кисспептина синцититрофоблас-том [4]. Несмотря на то, что авторы не нашли достоверной корреляции между уровнем де-цидуальных СБ16+ЫК-клеток и экспрессией кисспептина, наши данные подтверждают участие кисспептина в снижении этой субпопуляции клеток. Разночтения касаются, прежде всего срока гестации. Кисспептин способен угнетать экспрессию СБ 16 только в концентрации, которая наблюдается во второй половине беременности, в то время как корреляция проводилась на ранних сроках гестационного процесса [4].
Лептин, в отличие от всех изученных гормонов, оказывает не только дозозави-симые эффекты, но и разнонаправленные, что, по-видимому, связано с особенностями трансдукции его гормонального сигнала
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.