ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 6, с. 831-840
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575:599.9
ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ НОВЫХ ЭФФЕКТИВНЫХ ВНЕГЕННЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НОСИТЕЛЬСТВА ГЕМОФИЛИИ А
© 2007 г. В. Л. Сурин, А. В. Лукьяненко, Ю. А. Лучинина
Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 125167;
e-mail: vs@blood.ru Поступила в редакцию 19.04.2006 г.
В ходе поиска новых эффективных маркеров для генодиагностики гемофилии А исследованы два тринуклеотидных микросателлитных повтора (STR) из локусов Х-хромосомы, фланкирующих ген фактора VIII свертывания крови человека (F8): STR НА472 - CTT-повтор, локализованный рядом с геном GAB3 на расстоянии 163 тпн от З'-конца гена F8, и STR HA544 - повтор (CTT)^(ATT)y, расположенный на расстоянии 375 тпн от 5'-конца гена F8. Детальный анализ, проведенный с использованием ПЦР и секвенирования, показал, что STR HA472 содержит два протяженных вариабельных CTT-блока, разделенных небольшим спейсером CCTCCC. Наличие в спейсере сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы MnlI (ССТС) позволяет дифференциально тестировать полиморфные блоки и таким образом увеличивать информативность анализа. STR HA544 также представлен двумя полиморфными блоками (СТТ и АТТ), для которых разработаны максимально информативные системы раздельной амплификации. Исследование проводили на образцах ДНК 212 индивидов (125 женщин) из 48 семей, отягощенных гемофилией А. Полученные данные свидетельствовали о менделевском характере наследования изучаемых маркеров, большом числе аллельных вариантов и высокой гетерозиготности, которая составила 90% и 100% для НА544 и НА472 соответственно, что позволило нам эффективно использовать их для практической генодиагностики носительства и пренатальной диагностики гемофилии А. Помимо высокой информативности STR HA472 и HA544 обладают целым рядом диагностически важных свойств. Они удалены от гена F8 на меньшее расстояние, чем другие известные экстрагенные полиморфизмы, в отличие от динуклеотидных повторов легко тестируются без применения электрофоретических систем высокого разрешения и, кроме того, расположены с разных сторон от гена F8, что позволяет контролировать процесс гомологичной рекомбинации в данном локусе и избегать обусловленных им диагностических ошибок.
Гемофилия А относится к наиболее распространенным и тяжелым наследственным патологиям человека. Это Х-сцепленное заболевание связано с дефицитом фактора VIII свертываемости крови, встречается повсеместно со средней частотой 1 : 5000-10000 мужского населения и почти в половине случаев (30-50%) обусловлено мутациями de novo. Мутации в гене фактора VIII (F8) могут возникать как в единичных половых клетках, так и в ходе раннего эмбриогенеза [1]. Гемофилия А имеет рецессивный тип наследования и поэтому у женщин она проявляется лишь в тех исключительно редких случаях, когда дефектны оба аллеля гена F8 или имеет место асимметричная инактивация Х-хромосомы [2]. Ген фактора VIII локализован в прителомерной области длинного плеча Х-хромосомы (Xq28), занимает на ней около 187 тпн и состоит из 26 экзонов [3].
В настоящее время идентифицировано свыше 1000 различных генных дефектов, приводящих к гемофилии А. Наиболее полные их перечни содержатся в базах данных HAMSTeRS (The Haemophilia A Mutation, Structure, Test, Resource Site; http://
europium.csc.mrc.ac.uk) и HGMD (Human Gene Mutation Database, Cardiff; http://www.hgmd.cf.ac.uk). Большая их часть приходится на миссенс- и нонсенс-мутации, но с достаточно высокой частотой встречаются также мутации сплайсинга, микро-делеции, микроинсерции и протяженные делеции. В основном эти мутации уникальны, т.е. найдены у единичных пациентов, и только два нарушения относятся к часто повторяющимся событиям. Это прежде всего инверсии int22h-1/int22h-2.3 в области интрона 22, встречающиеся у 40-50% пациентов с тяжелой формой гемофилии А [4, 5], а также более редкая (5-10% пациентов с тяжелой формой заболевания) инверсия int1h-1/int1h-2 в области интрона 1 [6]. Обе инверсии являются следствием гомологичной внутрихромосомной рекомбинации между соответствующими интрон-ными участками и их внегенными гомологами.
В современной генодиагностике гемофилии А используются два основных подхода - прямая идентификация патологической мутации в гене F8 и косвенный семейный анализ по полиморфным маркерам, локализованным внутри гена F8
или в соседствующих с ним локусах Х-хромосомы [7-9].
Безусловно, молекулярно-генетическая диагностика, основанная на определении конкретного дефекта в гене F8, позволяет наиболее точно определять статус пациентки или плода относительно носительства заболевания, в том числе и в семьях со спорадической гемофилией (единственный больной, мутация de novo). Она дает возможность верифицировать дифференциальный диагноз заболевания, выявить корреляцию между генотипом и клиническим фенотипом и не требует расширенного семейного анализа. В то же время идентификация патологической мутации часто выливается в достаточно длительное, технически сложное и дорогостоящее исследование. Для тестирования инверсий int22h-1/int22h-2.3 в настоящее время преимущественно используют метод амплификации протяженных участков ДНК (LD-PCR) [10] или анализ мРНК при помощи RT-PCR [11]. Для поиска точечных дефектов требуется полный анализ первичной структуры мРНК или всех функционально значимых участков гена, что, принимая во внимание их значительные размеры (только кодирующие области гена составляют 7056 пн), является не самой простой задачей для быстрого решения. А необходимость в быстром получении ответа возникает достаточно часто, поскольку многие женщины обращаются за генетической консультацией только после наступления беременности, причем нередко на весьма значительных сроках. Следует также сказать, что при использовании описанной выше методологии в среднем у 2-3% пациентов с гемофилией А не удается выявить причинное генетическое нарушение [12, 13]. Вполне возможно, что в подобных случаях мутации лежат в тех областях гена F8, которые обычно не исследуются (например, интронные последовательности), или даже относятся к другим генам, имитируя гемофиличе-ский фенотип. Поэтому в реальной диагностической практике часто используется более экономичная и экспрессная альтернативная методология, основанная на семейном анализе полиморфизмов гена F8. Она позволяет осуществлять маркировку дефектного аллеля и прослеживать его пути в родословной. Установление статуса консультируемых относительно гемофилии и подбор маркеров для пренатальной диагностики занимают обычно 2-3 дня. Эффективность и надежность такого подхода напрямую зависят от количества применяемых полиморфных маркеров, их информативности и относительного расположения в локусе. Информативность маркера определяется его индексом гетерозиготности и характером сцепления с другими диагностическими полиморфизмами. Наибольшей информативностью обладают мини- и микросателлитные повторы типа VNTR и STR. Они, как правило, мультиаллельны и в раз-
личных популяциях гетерозиготность некоторых из них может существенно превышать 50%, достигая значений 0.7-0.8 и даже выше. Биаллель-ные SNP, тестируемые при помощи рестрикцион-ного анализа (ПДРФ-анализ), имеют более низкую информативность (максимальная теоретическая гетерозиготность - 0.5). Анализ носительства гемофилии А, проведенный при помощи нескольких информативных полиморфизмов, локализованных в разных частях гена, позволяет предельно снизить вероятность ошибочного диагноза, обусловленную кроссинговером. Основным недостатком данного подхода является невозможность точного установления носительства заболевания у женщин из семей со спорадической гемофилией. В таких случаях надежно определяется только отсутствие носительства.
В стандартный набор полиморфных маркеров, широко применяемых в ДНК-диагностике гемофилии А, входят: микросателлитные STR (CA)„ в интроне 13 [14] и (CA)„(CT)„ в интроне 22 гена F8 [15], несколько внутригенных SNP, распознаваемых рестрикционными эндонуклеазами [8], а также экстрагенный VNTR Stl4 в локусе DXS52 [16, 17]. Суммарная информативность анализа носительства гемофилии А по перечисленным полиморфизмам составляет около 90% [8]. При этом каждый маркер имеет свои достоинства и недостатки. Так, наиболее информативный полиморфизм St14, имеющий большое число аллелей и высокий индекс гетерозиготности (0.7-0.8), находится на значительном расстоянии от гена фактора VIII (около 1800 тпн) и поэтому риск диагностической ошибки, обусловленной возможной рекомбинацией между локусами F8 и DXS52, весьма велик и оценивается в 3-5% [18]. Между отдельными диагностическими SNP в различных популяциях наблюдается достаточно тесное, иногда почти полное, сцепление, вследствие чего суммарная информативность анализа при их совместном использовании по сравнению с индивидуальной информативностью увеличивается лишь незначительно [8]. Поэтому выявление новых полиморфных маркеров, повышаюших информативность и надежность ДНК-диагностики гемофилии А, остается актуальным.
Ранее, воспользовавшись базой данных NC-BI/SNP, мы выбрали несколько кандидатных SNP из разных участков гена F8 и, проанализировав их, показали диагностическую значимость полиморфизма AluI в интроне 1, характеризующегося высокой гетерозиготностью и отсутствием жесткого сцепления с основными SNP, применяемыми для генодиагностики гемофилии А [19]. Но в основном исследования в данной области, проводящиеся в разных лабораториях, направлены на выявление новых высокоинформативных мультиаллельных STR. Изучены дополнительные микросателлитные маркеры, расположенные внутри гена F8:
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в данной работе
Полиморфизм Название 5'-3'-последовательность
НА472 HA472D TCAAATGTCCTGTCATTGAGC
HA472R CCTCAACATCAGAATAGACC
НА544 HA544D GTGAAACTGTCCGTGTTTGT
HA544R ACAGAGTGAGACTCCATCTC
HA544RX GTATCAGGAACTTCATTGAAC
HA544DD CTTCTTCTTCTTCTTCTTATTA
HA544RR AAAATAATAATAATAATAAGAAG
^Т)„ в интроне 1, (СА)„ в нитронах 6 и 25, (AG)„ в интроне 24 [20-23]. Однако из перечисленных полиморфизмов, по вс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.