ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 10, с. 1108-1116
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 576.8.095.38:851.155
ХАРАКТЕРИСТИКА ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА В ПОПУЛЯЦИЯХ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ (Rhizobium leguminosarum), ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ
© 2015 г. Е. Е. Андронов1, 2, А. А. Иголкина1, А. К. Кимеклис1, Н. И. Воробьев1, Н. А. Проворов1
1Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии,
Санкт-Петербург 196608 e-mail: provorov@newmail.ru 2Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и биотехнологии,
Санкт-Петербург 199034 Поступила в редакцию 26.01.2015 г.
Путем высокопроизводительного секвенирования фрагмента гена nodA изучен популяционный полиморфизм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum (bv. viciae, bv. trifolii) в ризосферной почве и клубеньках бобовых растений из разных групп перекрестной инокуляции (Vicia sativa, Lathyruspratensis — группа вики/чины/гороха, Trifolium hybridum — группа клевера). При переходах бактерий из ризосферы в клубеньки частоты 10 из 23 операционных таксономических единиц (ОТЕ), выявленных при 95%-ном уровне сходства, достоверно возрастают либо снижаются в зависимости от вида растения-хозяина и филогенетического положения ОТЕ. Статистический и биоин-форматический анализ популяционных структур ризобий позволил предположить, что отбор, вызывающий эти изменения, является дизруптивным на уровне всей популяции и частотно-зависимым на уровне отдельных ОТЕ, обеспечивая дивергентную эволюцию бактерий, взаимодействующих с разными видами растений-хозяев.
Ключевые слова: естественный (дизруптивный, частотно-зависимый) отбор, дивергентная эволюция, клубеньковые бактерии (Rhizobium leguminosarum), бобово-ризобиальный симбиоз, вика посевная (Vicia sativa), чина луговая (Lathyrus pratensis), клевер гибридный (Trifolium hybridum), высокопроизводительное секвенирование, ген nodA.
DOI: 10.7868/S0016675815100021
Формирование и функционирование азот-фиксирующего бобово-ризобиального симбиоза сопровождается глубокими преобразованиями бактериальных популяций, происходящими при переходах ризобий из почвы и ризосферы в клубеньковые ниши, предоставляемые растениями-хозяевами [1]. Эти переходы связаны с сигнальными взаимодействиями партнеров: липо-хито-олигосахаридные Моё-факторы, синтезируемые ризобиями под контролем яо^-генов, воздействуют на растительные рецепторы, кодируемые ^^Я-генами и активирующие развитие клубеньков [2]. Колонизация ризобиями внутри- и межклеточных компартментов, формируемых при действии данных сигналов, сопровождается индукцией специфичных для симбиоза форм отбора, который направляет его эволюцию на повышение интенсивности М2-фиксации и экологической приспособленности партнеров [3].
Однако экспериментальные данные, позволяющие изучать направление, форму и интенсивность отбора, действующего в популяциях ризобий при симбиозе с бобовыми растениями, весьма ограничены. Это связано с тем, что анализ популяционной динамики ризобий проводили на небольших выборках штаммов, выделенных из почв или клубеньков с помощью традиционных микробиологических методов и представляющих ничтожно малую и нерепрезентативную часть генофонда этих бактерий.
Ранее с использованием метода высокопроизводительного секвенирования гена nodA (кодирует ацилирование Nod-факторов [2]) нами [4] выявлены резкие изменения генетической структуры популяций Rhizobium leguminosarum bv. trifolii при их миграции из почвы в клубеньки клевера Trifolium hybridum. В настоящей статье нами охарактеризована форма и направление отбора, вызывающего эти изменения, в более разнообразной популяции R. leguminosarum, которая состоит
из двух биотипов — bv. trifolii (ризобии клевера) и bv. viciae (ризобии вики/чины/гороха), взаимодействующих с совместно произрастающими растениями-хозяевами. Полученные данные показали, что отбор, происходящий в популяции ризобий при переходе из ризосферы в клубеньковые ниши, носит дизруптивный (разнообразящий) и частотно-зависимый характер, обеспечивая дивергентную эволюцию бактерий при взаимодействии с растениями из разных групп перекрестной инокуляции (ГПИ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использован экспериментальный материал, собранный на залежном поле под Вырицей (Гатчинский р-н Ленинградской обл., 59°24'7.74'' С; 30°15'28.74'' В). Было отобрано по 30 экз. растений с клубеньками, а также пробы ризосферной почвы для трех видов бобовых: Vicia sativa — вика посевная, Lathyrus pratensis — чина луговая (оба вида относятся к ГПИ вики/чины/гороха и вступают в симбиоз с Rhizobium leguminosarum bv. vici-ae) и Trifolium hybridum — клевер гибридный (из ГПИ клевера, вступает в симбиоз с R. leguminosarum bv. trifolii). Собранные с этих растений клубеньки объединили в три пула; также были созданы три пула почвы, полученные путем объединения образцов, отобранных из ризосферы вики, чины и клевера.
Каждую из клубеньковых проб замораживали жидким азотом, гомогенизировали и наряду с почвенными образцами использовали для выделения ДНК с помощью набора PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio, США). Очищенную ДНК использовали для постановки двухраундовой ПЦР с двумя парами праймеров. Для первого раунда использовали вырожденные праймеры на ген nodA ndARL268_F DGG HYTGTAYGGAGT-GC и ndARL591_R AGYTCSSACCCRTTT Во втором раунде использовали праймеры ndARL302_F AYTDGGMATCGCHCACT и ndARL518_R RDACGAGBACRTCTTCRGT. Данные праймеры позволяют с одинаковой эффективностью ам-плифицировать аллели гена nodA ризобий клевера, чины и вики. Использование двухраундовой ПЦР позволяет получать амплификат для почвенной ДНК, где доля гена nodA чрезвычайно низка. К праймерам, использованным во втором раунде ПЦР, добавляли служебные последовательности, включая адаптеры и мультиплексные идентификаторы, необходимые для пиросекве-нирования по протоколу фирмы Roche. Во всех реакциях ПЦР использовали высокоточную по-лимеразу Encyclo (Евроген, Россия) и температурный профиль: 95°С - 30 с, 50°С - 30 с, 72°С -30 с (35 циклов).
Библиотеки секвенировали на приборе GS Junior (Roche) в ЦКП "Геномные технологии и
клеточная биология" ВНИИСХМ. Для каждой библиотеки получили 3—4 тыс. последовательностей длиной около 200 пн, которые анализировали с использованием пакета QIIME. Анализ включал выбраковку коротких последовательностей, а также последовательностей, содержащих вставки и делеции со сдвигом рамки считывания; оставшиеся последовательности были рассортированы по мультиплексным идентификаторам на шесть библиотек. Последовательности выравнивали с использованием производительных алгоритмов (pyNAST), кластерный анализ и разбивку по операционным таксономическим единицам (ОТЕ; OTU-picking) проводили с использованием алгоритма UCLUST при 95%-ном уровне сходства. После удаления минорных ОТЕ, представленных 1—2 последовательностями, было оставлено 23 ОТЕ, для каждой из которых была выбрана репрезентативная последовательность, использованная для кластерного анализа.
Для оценки генотипического полиморфизма использовали индекс разнообразия Нея: HN =
= (l - ^Fi2)[n/(n — 1)], где Fi — частота i-го генотипа (ОТЕ), n — число выявленных ОТЕ [5, 6]. Для статистического анализа данных использовали í-критерий Стъюдента [7]. Для характеристики действующего на ризобии отбора модифицировали разработанную ранее [8] модель мультиштам-мовой конкуренции за образование клубеньков.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ полученных данных показал, что в шести субпопуляциях ризобий, выделенных из ризосферных почв и клубеньков трех видов растений, частоты 23 выявленных ОТЕ существенно (от 0 до 96.99%) варьируют в зависимости от происхождения ДНК-библиотеки (табл. 1, рис. 1). Для 10 наиболее многочисленных ОТЕ показаны достоверные различия частот встречаемости в ри-зосферных и клубеньковых библиотеках хотя бы одного вида растений, что говорит о положительном либо отрицательном отборе, действующем на данную ОТЕ при переходе бактерий в симбиоти-ческую фазу жизненного цикла. Важно отметить, что все ОТЕ, не показавшие изменений частот при переходе из ризосферы в клубеньки, относятся к числу минорных (частоты менее 0.3%) и, следовательно, отбор, связанный с инокуляцией растений, является важным условием поддержания высоких численностей штаммов в популяциях.
Использованы предложенные ранее [8] индексы инокуляции клубеньковых ниш («¡), характеризующие зависимость между частотами /-тых
штаммов в инокулюме (/■) и в клубеньках (). Их вычисляли по модифицированной формуле:
Таблица 1. Частоты (%) операционных таксономических единиц (ОТЕ), выявленных при анализе последовательностей гена nodA из ризосферных (Р) и клубеньковых (К) популяций Rhizobium leguminosarum, взаимодействующих с тремя видами бобовых
Происхождение nodA-последовательностей
ОТЕ (рис. 1; OTU) Vicia sativa Lathyrus pratensis Trifolium hybridum
Р К P К Р К
1 0 0 0 0 0.3 + 0.03 0.11 + 0.05
3 0 0.7 + 0.04 0 0 0.27 + 0.07 0.11 + 0.05
10 0 0.02 + 0.02 0.02 + 0.02 0 0.73 + 0.14 0.05 + 0.04^
11 0 0 0.02 + 0.02 0 0.27 + 0.07 0.22 + 0.06
17 0.08 ± 0.05 0.02 + 0.02 0.17 + 0.06 0.03 + 0.03 0.03 + 0.03 0
12 0 0 0.02 + 0.02 0 0.05 + 0.04 0
4 0.03 + 0.03 0 0.02 + 0.02 0 0 0
23 15.71 + 0.59 1.89 + 0.21¿ 16.42 + 0.58 0.25 + 0.08^ 75.73 + 0.61 82.89 + 0.52t
20 1.01 + 0.16 0.10 + 0.05^ 0.15 + 0.06 0.11 + 0.05 2.91 + 0.19 15.07 + 0.58t
7 0.05 + 0.03 0 0.02 + 0.02 0 0.14 + 0.05 0.09 + 0.05
21 0.69 + 0.14 0.02 + 0.02^ 0.10 + 0.05 0.08 + 0.05 1.64 + 0.20 1.19 + 0.16
19 0.05 + 0.03 0 0 0 0.03 + 0.03 0.16 + 0.05
14 0.03 + 0.03 0 0 0 0 0
5 0.05 + 0.03 0 0 0.03 + 0.03 0.03 + 0.03 0
9 0 0 0Л0 + 0.05 0 0 0
2 0.03 + 0.03 0.05 + 0.04 0 0.03 + 0.03 0 0
16 1.07 + 0.17 1.30 + 0.18 0.07 + 0.04 0.63 + 0.13t 0 0
13 0 0 0 0.05 + 0.03 0 0
18 1.15 + 0.17 5.38 + 0.36t 1.05 + 0.16 1.01 + 0.16 0 0
0 0 0.39 + 0.10t 0.05 + 0.03 0.16 + 0.07 0 0
22 78.85 + 0.67 83.53 + 0.58t 81.76 + 0.02 96.99 + 0.28t 18.15 + 0.22 0.11 + 0.04^
15 1.20 + 0.18 6.87 + 0.40t 0.02 + 0.02 0.63 + 0.13t 0 0
8 0 0.34 + 0.09t 0 0 0 0
N 3749 4073 4111 3650 3713 4472
Примечание. Частоты ОТЕ указаны со стандартными ошибками. Стрелки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.