ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26
ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ГРИБОВ ПО РАСПИСАНИЮ ПОЯВЛЕНИЯ КОЛОНИЙ НА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ
© 2014 г. С. А. Харин*, А. В. Кураков**, 1
*Институт медико-биологических проблем Российской академии наук **Биологический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Поступила в редакцию 17.04.2013 г.
Доказана применимость уравнения распределения Пуассона для описания динамики появления грибных колоний в посевах чистых культур и природных образцов, что указывает на возможность использования подхода Хаттори для оценки физиологического состояния грибов. По показателям — времени задержки появления колоний и X — потенциальной способности клеток к размножению выявлены различия в физиологической активности грибов разных видов, находящихся в форме спор и мицелия, а также грибных популяций в различных местообитаниях.
Ключевые слова: грибы, метод посева, физиологическое состояние, лаг-фаза, вероятность размножения, распределение Пуассона, уравнение Хаттори, почва, дождевые черви.
БОТ: 10.7868/80026365614010054
На протяжении более ста лет метод посева являлся основным экспериментальным приемом, позволяющим микробиологам проводить разнообразные исследования. С помощью этого метода оценивают относительное обилие и изолируют чистые культуры микроорганизмов из природных и техногенных местообитаний, изучают спектры утилизируемых соединений, влияние физико-химических факторов на рост микроорганизмов. Метод посева позволяет определить также физиологическое состояние микробных популяций в природе. Активность микробных популяций и формирующихся из них сообществ микроорганизмов неодинакова в разнообразных по условиям средах обитания. Достаточно очевидно, что это связано с такими внешними факторами, как влажность, температура, доступность питательных элементов, кислорода, кислотность среды, наличия токсикантов, а также зависит от стадий жизненного цикла организмов, видового состава сообщества. Пионерные исследования в этой области связаны с именем японского микробиолога Тсутому Хаттори [1, 2]. В результате сравнительных наблюдений за посевами разных видов бактерий на твердые питательные среды им было установлено, что их колонии при прочих равных условиях (температуре, составе питательной среды и т.д.) имеют различную динамику появления. Детальное изучение времени обнаружения видимых колоний показало, что динамика их появления на твердых питательных средах подчиняется
1 Автор для корреспонденции (е_шаП: kurakov57@mail.ru).
распределению Пуассона и описывается уравнением:
N(0 = N„(1 - ^ - г)) ц > гг), (1)
где N(0 — количество колоний в момент времени N„1 — финальное число колоний; X — вероятность образования колоний отдельной клеткой популяции в единицу времени; — время задержки (включающее в себя лаг-период и время до образования видимой невооруженным глазом колонии). N(0 и ? являются переменными значениями, а X и — постоянными параметрами, характеризующими физиологическое состояние бактериальных популяций [3, 4].
Подсчет образовавшихся на твердой питательной среде колоний через определенные интервалы времени позволяет составить расписание появления колоний и затем вычислить параметры X и В соответствии с распределением Пуассона некоторое событие, запускающее процесс размножения клетки, происходит с вероятностью в единицу времени X, а результатом процесса будет появление колоний через время Показатель X характеризует потенциальную способность клеток к размножению, причем между X и скоростью размножения "потомства" нет прямой связи. Поэтому вероятность размножения клеток должна изменяться на разных стадиях развития микроорганизмов, зависеть от стрессов, содержания запасных веществ в клетке и т.д. [3, 5].
Именно таким образом Хаттори с соавторами [2—4, 6] в своих исследованиях определили физиологическое состояние для чистых культур бак-
83
6*
терий олиготрофных и копиотрофных видов. Значения X для активных бактериальных клеток были более 0.042 ч-1, для покоящихся клеток X < 0.021 ч-1, а клетки с показателями 0.042 ч-1 < < X < 0.021 ч-1 находились в промежуточной фазе клеточного цикла развития. Предложенный им подход позволил дать количественную оценку различиям в активности бактериальных популяций в разнообразных эконишах, почвах разных типов, а также в ризосфере и водоемах [2-6]. Несмотря на эффективность данного подхода в исследованиях экологии бактерий, не было предпринято попыток показать возможность его использования и перспективность для характеристики физиологического состояния грибов в различных условиях их развития.
Целью работы было выяснение применимости подхода Хаттори для оценки физиологического состояния грибов в чистых культурах и грибных популяций в природных местообитаниях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микромицеты. Оценку физиологического состояния грибов проводили для : культур Aspergillus niger 3П42 и Alternaría alternata 1С321 (споровой и мицелиальной форм); штамма Penicillium auran-tiogriseum 5П623, инокулированного в стерильную дерново-подзолистую почву; комплексов (популяций) микроскопических грибов нативной дерново-подзолистой почвы; пищеварительного тракта, его содержимого и копролитов дождевых червей Aporrectodea caliginosa, обитающих в этой почве.
Для получения мицелиальной суспензии культуры Asp. niger и Al. alternata выращивали на твердой среде Чапека в течение одних суток при 27°C. Такая продолжительность инкубации давала возможность получить мицелий грибов без конидий. Биомассу мицелия переносили в пробирку со стерильной водой, измельчали, встряхивая ее на вортексе в течение 5 мин, и разбавляли стерильной водой до концентрации не более 50 КОЕ на 100 мкл суспензии. Споры Asp. niger и Al. alternata получали после семисуточного культивирования грибов на среде Чапека при 27°C. Исходную споровую суспензию готовили смывом конидий стерильной водой с поверхности колоний, и затем разбавляли до концентрации 10-50 спор в 100 мкл суспензии.
Почва. Использовали свежие образцы окультуренной дерново-подзолистой почвы под бобо-во-злаковой растительностью с многолетнего опыта кафедры агрохимии МГУ имени М.В. Ломоносова (Московская область, Почвенно-эко-логический центр МГУ "Чашниково"). Содержание общего углерода в почве - 1.72%, азота -0.13%, pH водной вытяжки - 5.7. В 1989 г. была
применена известь в дозах, достаточных для нейтрализации гидролитической кислотности. Почва получала в течение 1990-1999 гг. 340 т/га органических удобрений и минеральные удобрения N100P500K500 в год. В течение 1994-1999 гг. вносили в среднем N100P40K100 в год.
Дождевые черви. Дождевые черви Aporrectodea caliginosa были отобраны из горизонта 0-20 см исследуемой почвы. Червей содержали в садках с почвой при 12-15°C.
Для получения содержимого желудка и очищенного пищеварительного тракта червя его помещали на 1 с в воду при 100°C, и затем на морозильный столик (элемент Пелтье), где он охлаждался до - 16°C за 20-30 с [7]. Далее производили вскрытие червя и в момент размораживания извлекали содержимое кишечника и пищеварительный тракт. Очищение пищеварительной системы червей от почвы и растительных остатков проводили в стаканчиках на 100 мл со стерильным песком в течение 5-7 дней (по 3-5 червей в стакане).
Образцы свежих копролитов получали путем выдерживания червей в чашках Петри на увлажненной стерильной фильтровальной бумаге при температуре 4-5°C в течение нескольких часов. Использовали также трехсуточные копролиты после инкубации червей на поверхности почвы в течение 3 сут.
Для оценки физиологического состояния грибов составляли расписание появления колоний грибов на плотной среде и оценивали соответствие полученного расписания распределению Пуассона согласно подходу Хаттори. Критерием соответствия служило равенство среднего и дисперсии, которое является основным признаком распределения Пуассона и может использоваться для его доказательства [8]. Посевы проводили на глюкозо-пептонно-дрожжевой агар (ГПДА), (г/л): глюкоза - 1.0; пептон - 2.0; дрожжевой экстракт - 1.0; гидролизат казеина - 1.0; КН2РО4 -0.5; K2HPO4 - 0.5; агар - 15.0; 1 л водопроводной воды, pH 7.2. Рост бактерий подавляли добавлением в среду стрептомицина (30 мг/л). Десорбцию грибов с частиц почвы, содержимого кишечника, пищеварительного тракта и копролитов A. caliginosa проводили в гомогенизаторе DIAX 9000 ("Heidolph"). Чашки с посевами инкубировали в термостате при 27° C и через определенные промежутки времени учитывали количество вновь образовавшихся колоний, отмечая их маркером на обратной стороне чашки Петри. Опыты проводили в десятикратной повторности чашек с периодичностью подсчета колоний каждые 3-8 ч в течение 3-14 сут с момента появления первой колонии. В случае соответствия их появления распределению Пуассона, т.е. применимости уравнения (1), оценивали физиологическое со-
стояние грибных популяций по показателям вероятности размножения X и продолжительности лаг-фазы из уравнения (1). Эти параметры вычисляли линейным способом метода наименьших квадратов по имеющимся экспериментальным данным N(0 и I согласно расписанию появления колоний.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Доказательство применимости распределения Пуассона для описания динамики появления грибных колоний на твердой среде. Условием применения уравнения (1) для определения — длительности лаг-фазы и X — вероятности размножения клеток, которые характеризуют их физиологическое состояние, служит соответствие расписания появления колоний микроорганизмов распределению Пуассона:
Р (х) = Хсхр ^Хср/х!, (2)
где х — дискретная величина, х! — факториал дискретной величины, Р(х) — вероятность проявления значений этой величины, хср — среднее значение дискретной величины (параметр распределения), е — основание натурального логарифма 2.7182.
Одним из доказательств того, что на твердых питательных средах колонии появляются с частотой, соответствующей распределению Пуассона, является достоверное равенство среднего числа появления колоний в единицу времени на одной
чашке Петри и дисперсии этого среднего [5]:
—
*ср = а ,
(3)
где хср — с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.