МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 2, с. 225-235
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.232:579.26:575.113
ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ 8ЛССНЛЯОМУСЕ8 ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО ВИНОДЕЛИЯ
© 2007 г. Ю. В. Иванникова*, Е. С. Наумова*, Н. Н. Мартыненко**, Г. И. Наумов*1
*Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов (ГосНИИгенетика), Москва
**Московский государственный университет пищевых производств Поступила в редакцию 23.03.2006 г.
С помощью рестриктазного анализа некодирующих участков рДНК, множественной ПЦР и молекулярного кариотипирования изучены штаммы Saccharomyces, выделенные из материалов для плодово-ягодного виноделия в России, Беларуси и на Украине. Молекулярным анализом установлено, что все штаммы относятся к виду & cerevisiae. Обнаружена корреляция между микросателлитными маркерами штаммов и источником их выделения. Штаммы, изолированные из соков и с поверхности ягод различных плодово-ягодных растений отличаются по ПЦР-профилям. Изучен состав геномов межвидовых гибридов Saccharomyces естественного и лабораторного происхождения.
Ключевые слова: гибриды Saccharomyces cerevisiae х Saccharomyces bayanus, ПДРФ-анализ, множественная ПЦР, молекулярное кариотипирование, филогенетический анализ, мтДНК.
В настоящее время род Saccharomyces включает шесть биологических видов: S. cerevisiae, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus и гибридный таксон S. pastorianus (син. S. carlsbergensis) [1, 2]. Дрожжи S. cerevisiae и S. bayanus связаны с ферментационными процессами и очень редко встречаются в природе.
Биологический вид S. bayanus представлен двумя разновидностями - S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum, которые частично экологически изолированы и отличаются последовательностями некодирующих участков рДНК: внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1 и межгенного спейсера IGS2 [1, 3, 4]. К S. bayanus var. bayanus, кроме типовой культуры CBS 380, относятся некоторые другие штаммы, выделенные в условиях пивоварения. Специфической экологической нишей S. bayanus var. uvarum является виноделие при низких температурах, причем эти дрожжи преобладают в определенных типах вин [5].
Винные дрожжи S. cerevisiae, S. bayanus var. uvarum и их гибриды могут встречаться в смешанных популяциях [5-7]. Среди винных дрожжей обнаружен естественный аллотетраплоидный гибрид S6U, содержащий геномы S. cerevisiae и S. bayanus var. uvarum [8]. Известен триплоидный штамм CID1 из сидра, являющийся гибридом трех видов S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum х S. kudriavzevii [9, 10]. Нами недавно найдены гибриды S. cerevisiae х х S. bayanus var. uvarum среди пекарских дрожжей
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
и изолятов с ягод черной смородины [11]. Обнаружение винных штаммов S. bayanus var. uvarum дает возможность использовать их генофонд в селекционных программах. Показано, что межвидовые гибриды S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum обладают высокой ферментационной способностью при низких температурах и улучшают композицию шампанского и игристых вин [12, 13]. Гибридное происхождение имеют также пивные дрожжи низового брожения S. pastorianus, представляющие собой ал-лотетраплоид, по-видимому, S. cerevisiae х S. bayanus var. bayanus [10, 14].
Данная работа является продолжением нашего предыдущего исследования [11]. Мы провели молекулярный анализ 50 штаммов Saccharomyces, выделенных с поверхности ягод плодово-ягодных растений и из различных ферментационных процессов в России, Беларуси и Украине. В задачу исследования также входило сравнительное изучение состава генома естественных и лабораторных гибридов дрожжей Saccharomyces.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изученные штаммы и их происхождение приведены в табл. 1. В качестве видовых тестеров использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-502, S. bayanus var. uvarum ВКМ Y-1146 и типовые культуры S. bayanus var. bayanus CBS 380, S. cariocanus UFRJ 50816, S. kudriavzevii IFO 1802, S. mikatae IFO 1815 и S. paradoxus CBS 432.
Таблица 1. Происхождение изученных штаммов дрожжей Saccharomyces
Видовое и оригинальное название штамма Коллекционный номер Происхождение Место выделения
Saccharomyces cerevisiae
- ВКМ Y-502 Ягоды винограда Дальний Восток, Россия
Брусничная-7 ЦКМ-4 Брусничный сок Санкт-Петербург, Россия
Ленинградская М-307 Шампанские акратофоры Санкт-Петербург, Россия
К-17 ЦКМ-67 Клюквенный сок Ленинградская обл., Россия
Крыжовниковая-48 ЦКМ-24 Крыжовниковый сок Ленинградская обл., Россия
Крыжовниковая-27 М-129 Крыжовниковый сок неизвестно
Земляничная-4 ЦКМ-31 Земляничный сок Ленинградская обл., Россия
Земляничная-9 М-120 Земляничный сок неизвестно
Земляничная Виктория 14 М-72 Земляничный сок неизвестно
Малиновая Ленинградская ЦКМ-27 Малиновый сок Ленинградская обл., Россия
Москва-30 М-126 Клюквенное вино Москва, Россия
Корнет - Шампанские акратофоры Москва, Россия
Сливовая-21 М-353 Сливовый сок Курск, Россия
Слива-23 ЦКМ-14 Сливовый сок Курск, Россия
Груша-7 М-351 Грушевый сок Курск, Россия
Груша-10 М-352 Грушевый сок Курск, Россия
Вишневая-33 ЦКМ-7 Вишневый сок Курск, Россия
Вишня 18 М-17 Вишневый сок Курск, Россия
Вишневая-6 М-135 Вишневый сок неизвестно
Малиновая-10 ЦКМ-9 Малиновый сок Курск, Россия
Малиновая-28 М-122 Малиновый сок неизвестно
Черносмородиновая-7 М-81 Черносмородиновый сок Курск, Россия
Черносмородиновая-22 - Черносмородиновый сок неизвестно
Смородиновая-5 ВКМ Y-559 Смородиновый сок неизвестно
Сидровая-101 М-56 Яблочный сок Курск, Россия
Яблочная 7 М-132 Яблочный сок Курск, Россия
Весьегонск-3 ЦКМ-1 Клюквенный сок Тверская обл., Россия
Киевская М-516 Шампанские акратофоры Киев, Украина
Харьковская 39 М-212 Шампанские акратофоры Харьков, Украина
Магарач 17-35 М-440 Виноградное вино Крым, Украина
Магарач 125 М-268 Виноградное вино Крым, Украина
Массандра 3 М-83 Виноградное вино Крым, Украина
Каберне-5 М-25 Виноградное вино Крым, Украина
Холодостойкая 21 М-150 Виноградное вино Крым, Украина
Кокур-3 М-279 Виноградное сусло Крым, Украина
Феодосия-1-19 М-271 Виноградное сусло Крым, Украина
ВВ-1 КБП-3792 Виноград Волковысский р-н, Беларусь
ВВ-2 КБП-3793 Виноград Волковысский р-н, Беларусь
ВЧР-3 КБП-3789 Черноплодная рябина Волковысский р-н, Беларусь
ГВ-1 КБП-3790 Виноград Гродненский р-н, Беларусь
ГВ-4 КБП-3791 Виноград Гродненский р-н, Беларусь
ГСЧ-1 КБП-3781 Черная смородина Гродненский р-н, Беларусь
ГМ-8 КБП-3786 Лесная малина Гродненский р-н, Беларусь
Таблица 1. Окончание
Bидовое и оригинальное название штамма Коллекционный номер Происхождение Место выделения
TM-15 КБП-3787 Лесная малина Гродненский р-н, Беларусь
TM-17 КБП-3788 Лесная малина Гродненский р-н, Беларусь
ДЧК-1 КБП-3785 Черника Дятловский р-н, Беларусь
Яблочная Анис-6 M-70 Яблочное вино неизвестно
Яблочная-17 M-15 Яблочное вино неизвестно
Штейнберг 92 M-93 Шампанское неизвестно
47-К M-527 Шампанское неизвестно
Шампань ПЯ-16 M-137 Шампанское неизвестно
S6U
Шампанская-11/12
ГСЧ-5
ГСЧ-8
ГСЧ-11
Л-80-4
Saccharomyces bayanus var. bayanus
CBS 380 (Т)
Пиво
неизвестно
Saccharomyces bayanus var. uvarum
BКM Y-1146 MCYC 623
Ягоды винограда
Mesophylax adoperus
Mичyринcк, Россия Испания
Saccharomyces pastorianus (S. cerevisiae x S. bayanus var. bayanus)
CBS 1538 (Т) CBS 1513
M-239 КБП-3782 КБП-3783 КБП-3784
Пиво Пиво
S. cerevisiae х S. Ьауапш уаг. татт Вино
Шампанское Черная смородина Черная смородина Черная смородина Пекарские
Дания Дания
Италия
лабораторный гибрид Гродненский р-н, Беларусь Гродненский р-н, Беларусь Гродненский р-н, Беларусь Московский дрожжевой завод
S. cerevisiae x S. bayanus var. uvarum x S. kudriavzevii
CID1 CBS 8614 Яблочный сидр Франция
S. paradoxus CBS 432 (Т) Неизвестно неизвестно
S. cariocanus UFRJ 50816 (Т) Drosophila sp. Бразилия
S. kudriavzevii IFO 1802 (Т) Растительный опад Япония
S. mikatae IFO 1815 (Т) Растительный опад Япония
Примечание. Cокращенные названия коллекций: КБП - коллекция кафедры биологии почв MГУ, Mоcква; BRM - Bcероccий-ская коллекция микроорганизмов, Mоcква; M - Коллекция Института винограда и вина (ИBиB) "Mагарач", Ялта; ЦКM - Центральная коллекция Mинcельxоза России "Чистые культуры дрожжей, применяемые при производстве пива, безалкогольных напитков и вина", Cанкт-Петербyрг; CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands; IFO - Institute for Fermentation, Osaka, Japan; UFRJ - Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil. Т - типовая культура.
В качестве контролей также привлекали типовую культуру гибридного таксона S. pastorianus CBS 1538 и гибридные штаммы S6U и CID1.
ПЦР-анализ. Дрожжи культивировали при 28°C в течение 2-3 сут на полной среде YPD (г/л): бакто-агар - 20, дрожжевой экстракт - 10, пептон - 10 и глюкоза - 20. Выделение ДНК из клеток дрожжей проводили по методике, описанной ранее [11]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик ТМ" (Россия). Амплификацию гена 5.8S рРНк и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и
ITS2 (5^-П^-фрагмент) проводили с помощью праймеров ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [1]. В качестве молекулярных маркеров использовали также гены MET2 и ACT1, кодирующие, соответственно, фермент Z-гомосерин-О-ацетил-трансферазу и структурный белок актин. Амплификацию генов MET2 и ACT1 проводили, соответственно, с праймерами MET23 (5'-CGA-AAACGCTCCAAGAGCTGG-3), MET25 (5 -GAC-CACGATATGCACCAGGCAG-3) и ACT15 (5'-TATCGTCGGTAGACCAAGACA-3'), ACT13
MИКPOБИOЛOГИЯ том 76 < 2 2007
6*
(5'-AGATCCACATTTGTTGGAAGG-3') [10]. ПЦР осуществляли в 30 мкл смеси, содержащей ПЦР-буфер (20 мМ (NH4)2SO4), 3 мМ MgCl2, 0.25 мМ каждого дНТФ, 50 пмоль каждого праймера, 0.5 ед. Taq-полимеразы ("Синтол", Россия) и 20-200 нг анализируемой геномной ДНК. Амплификацию 5^-П^-фрагмента, геновMET2 и ACT1 осуществляли в следующем режиме: начальная денатурация ДНК при 94°С, 5 мин, затем 30 циклов с денатурацией ДНК при 94°С, 2 мин, отжигом праймеров при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.