МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 312-319
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22:615.919:639.27
ХАРАКТЕРИСТИКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СКРИНИНГ НА ПРОДУКЦИЮ ТЕТРОДОТОКСИНА БАКТЕРИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НЕМЕРТИНОЙ CEPHALOTRIX SIMULA (IVATA, 1952)
© 2014 г. И. А. Беленёва*, ^ Т. Ю. Магарламов*, А. Д. Кухлевский**
*Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток **Дальневосточный федеральный университет, Владивосток Поступила в редакцию 06.10.2013 г.
Впервые проведено исследование таксономического состава бактерий, ассоциированных с немер-тиной Cephalotrix simula, и скрининг бактерий на продукцию тетродотоксина (ТТХ) с использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и поликлональных антител. Идентифицировали бактериальные изоляты по результатам секвенирования последовательностей гена 16S рРНК и анализа фенотипических характеристик. Впервые выявлено, что продуцентом ТТХ в немертине C. simula является представитель рода Bacillus. Преобладающими в составе ассоциативной микрофлоры были Vibrio spp. (68.18% от общего числа изолятов). Анализ чувствительности штаммов к 16 антибиотикам различных классов выявил полирезистентность (устойчивость к трем и более антибиотикам) у всех изученных изолятов. Скудный рост большинства изолятов на всех лабораторных средах является косвенным подтверждением симбиотических взаимоотношений между микро- и макроорганизмом.
Ключевые слова: морские гетеротрофные бактерии, ассоциации, немертины, продукция тетродотоксина.
DOI: 10.7868/S0026365614030057
Немертины (тип Nemertea) являются, главным образом, морскими беспозвоночными животными, широко распространенными в прибрежных зонах повсеместно. Они обитают в различных отложениях, и многие из них ведут хищнический образ жизни. Для захвата добычи они имеют уникальный орган — хоботок и, кроме того, многие из 1200 известных видов обладают тетродотокси-ном, который позволяет им защищаться от врагов и более успешно охотиться [1].
Наличие тетродотоксина у немертин представляет огромный интерес в связи с широким распространением этих животных в морских экосистемах. Помимо немертин тетродотоксин обнаружен у целого ряда других гидробионтов — головоногих, брюхоногих и двустворчатых моллюсков [2], членистоногих [3], иглокожих [4], а также у представителей различных типов морских червей [5].
Вопрос о происхождении тетродотоксина в морских организмах до сих пор является дискуссионным. Сторонники эндогенной теории считают, что нейротоксин вырабатывает непосред-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: beleneva.vl@mail.ru).
ственно организм животных. Следует отметить, однако, что слишком большие индивидуальные различия в токсичности рыбы фугу, а также зависимость токсичности от места их вылова не могут объяснить эндогенное происхождение тетродотоксина [6]. Сторонники экзогенной гипотезы убеждены, что аккумуляция токсина происходит по пищевым цепям, первым звеном в которых являются бактерии. Помимо накопления в пищевых цепях возможна продукция токсина симбио-тическими или паразитическими бактериями. Подтверждением тому являются многочисленные факты выделения из ядовитых морских животных бактерий, способных продуцировать тет-родотоксин [7, 8].
В немертинах также выявлены бактериальные продуценты тетродотоксина [9]. Однако исследователи ограничиваются характеристикой штаммов, продуцирующих тетродотоксин, за пределами внимания оставляя вопросы, касающиеся разнообразия и свойств всей бактериальной микрофлоры, населяющей органы и ткани ядовитых немертин. Кроме того, остается неизвестным, какова доля продуцентов токсина от общего
числа ассоциированных с животным бактерий, и является ли она постоянной величиной, а также представители каких бактериальных таксонов наиболее часто являются продуцентами токсина.
Целью настоящей работы было изучение свойств, особенностей таксономического состава культивируемых бактерий, ассоциированных с организмом C. simula, и выявление среди них продуцентов тетродотоксина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животных собирали в бухте Авангард залива Петра Великого в июне 2012 г. Каждый образец тщательно троекратно отмывали стерильной морской водой для удаления микроорганизмов с поверхности животных. Общую пробу из 5 немер-тин тщательно растирали до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе. Затем в гомогенат добавляли стерильный физиологический раствор NaCl до объема 1 мл (нативный гомогенат), который по 0.1 мл на чашку Петри высевали на TCBS агар, и после серии разведений для изоляции отдельных колоний — на плотную среду Йошимицу—Кимура Y—K [10] следующего состава: пептон (5.0 г), дрожжевой экстракт (2.0 г), глюкоза (1 г), К2НРО4 (0.2 г), MgSO4 • 7H2O (0.1 г), агар (12.0 г), дистиллированная вода (500 мл), и морская вода (500 мл); рН среды 7.8— 8.0. Посевы культивировали при температуре 23° С на чашках с TCBS agar двое сут, со средой Y—К — в течение 6 сут. Бактериальные изоляты трижды пересевали на соответствующую среду для получения чистой культуры. В дальнейшем вибрионы культивировали на щелочном дрожжевом агаре, ГРМ-агаре (Оболенск, Россия), Caso-agar ("Merck", Германия), Marine agar 2216 (США). Остальные штаммы выращивали на среде Y—К и морском агаре Marine agar 2216.
Тесты на реакцию по Граму, подвижность, ци-тохромоксидазу, утилизацию источников углерода, образование кислых продуктов из углеводов, устойчивость к антибиотикам, потребность в ионах Na+, рост при различных температурах, значениях рН и солености среды изучали, как описано ранее [11]. Гидролиз желатины и крахмала исследовали согласно [12]. Дополнительно биохимическое тестирование штаммов вибрионов проводили с использованием тест-систем СИБ ("Микроген", Россия), а остальных изоля-тов — систем API 20NE ("bioMérieus", Франция). Идентификацию изолятов проводили на основе результатов анализа биохимических характеристик и секвенирования последовательностей гена 16S рРНК.
Для выявления тетродотоксин-положитель-ных штаммов использовали метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Штаммы
выращивали на среде Y—К в течение 2 сут, затем бактериальные клетки смывали с поверхности агара стерильной морской водой в микропробирки и мягко осаждали на центрифуге (minispin, "Eppendorf") при 3000 g в течение 10 мин. К осадку добавляли 4% параформальдегид на фосфатном буфере (ФБ) следующего состава: 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 6.4 мМ Na2HPO4, 1.2 мМ KH2PO4, pH 7.4, фиксировали в течение 1 ч при комнатной температуре и отмывали ФБ. Фиксированный материал обезвоживали в возрастающей концентрации спиртов и ацетоне и затем заключали в водорастворимую смолу (LR White) (EMS). Полутонкие срезы толщиной 0.9 мкм получали на ультракате (Ultracat E, "Reichert", Германия) и переносили на предметные стекла. Полутонкие среды пермобилизировали в течение 1 ч 1% тритоном Х-100 ("Aldreach") на ФБ, затем отмывали ФБ и в течение 1 ч инкубировали в блокирующем растворе, содержащем 1% БСА и 10% нормальную сыворотку козы ("Invitrogen") на ФБ. Для выявления ТТХ срезы инкубировали в течение 2 сут при 4°С в растворе первичных антител против ТТХ (поликлональные антитела кролика, разведение 1 : 25) ("Abnova") на ФБ, содержащем 1% БСА, затем отмывали ФБ и инкубировали в растворе вторичных антивидовых антител, меченых Alexa 488 ("Invitrogen", США) в концентрации 1 : 800 на ФБ в течение 2 ч при комнатной температуре. Срезы отмывали ФБ и заключали в Мoviol ("Aldrich"). Образцы исследовали на конфокальном микроскопе LSM-510 Meta ("Carl Zeiss", Германия). Полученные фотографии были обработаны с помощью программного обеспечения CLSM-510 Meta.
Анализ на антимикробную активность изоля-тов в отношении типовых штаммов тест культур Escherichia coli ATCC 15034, Bacillus subtilis BKM B501, Candida albicans KMM 455, Pseudomonas aeruginosa KMM 433 и Staphylococcus aureus ATCC 21027 проводили как описано ранее [11].
Бактериальные штаммы сохраняли в криопро-бирках при —85°C на морской воде с 30% глицерина, 1% пептона ("Difco") и MgSO4 (3-5 г/л) в коллекции морских гетеротрофных бактерий ИБМ ДВО РАН.
Выделение ДНК, амплификация, секвенирова-ние и анализ последовательностей. Тотальную ДНК экстрагировали из 1 мл бактериальной культуры стандартным методом [13]. Условия амплификации 16S рРНК гена, проведения сикве-нальной реакции и первичной обработки данных подробно описаны ранее [14]. Видовую принадлежность штаммов устанавливали, сравнивая полученные последовательности с имеющимися в генетическом банке (NCBI/GenBank) и на основании биохимических тестов. Полученные таким образом фрагменты последова-
Таблица 1. Таксономическое положение бактериальных штаммов, ассоциированных с C. simula
№ штамма № в Генбанке (GenBank) Близкородственный организм Идентичность, %
1796 KF444392 Vibrio sp. 04Ya001 (AB571866) 99.8
1797 KF444393 Vibrio sp. 04Ya001 (AB571866) 100
1798 KF444394 Vibrio sp. 04Ya001 (AB571866) 99.9
1799 KF444395 V. atlanticus LMG 24300 (EF599163) 99.0
1800 KF444396 V. atlanticus LMG 24300 (EF599163) 99.0
1801 KF444397 V. atlanticus LMG 24300 (EF599163) 99.0
1802 KF444398 V. splendidus AP57 (HE584792) 99.5
1803 Н/д Bacillus circulans Н/д
1804 KF444399 Kistimonas sp. A36 (JF811908) 98.2
1805 KF444400 V. splendidus PB1-10rrnH (EU091332) 99.0
1806 KF444401 Vibrio sp. клон KWE30-5 (JQ670709) 98.0
1807 KF444402 V. splendidus PB1-10rrnH (EU091332) 99.9
1808 KF444403 Vibrio sp. клон KWE30-5 (JQ670709) 97.9
1809 KF444404 Bacillus sp. P307 (FJ943260) 100
1810 Н/д Pseudoalteromonas sp. Н/д
1811 KF444405 Vibrio sp. клон KWE30-5 (JQ670709) 98.0
1812 KF444406 Salegentibacter mishustinae(AB681203) 99.8
1813 KF444407 Pseudoalteromonas sp. SS12.19 (KC160911) 100
1814 KF444408 V. splendidus PB1-10rrnH (EU091332) 99.2
1815 KF444409 V. splendidus PB1-10rrnH (EU091332) 99.9
1816 KF444410 Vibrio клон KWE30-5 (JQ670709) 98.0
1839 KF444412 Bacillus sp. CU040510-015 (FJ188310) 99.8
тельностей генов 168 рРНК депонировали в генбанке (^444392-^444416). Для построения филогенетического дерева использовали последовательности 168 рРНК генов видов бактерий, близких к нашим штаммам
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.