ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 413, № 4, с. 561-563
КЛЕТОЧНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ
УДК 575.11:575.21:575.22:591.557:595.773.4
ХАРАКТЕРИСТИКА ИНФИЦИРОВАННОСТИ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМ ЭНДОСИМБИОНТОМ WOLBACHIA ПОПУЛЯЦИИ DROSOPHILA MELANOGASTER УМАНИ
© 2007 г. Ю. Ю. Илинский, И. К. Захаров
Представлено академиком В.К. Шумным 13.09.2006 г. Поступило 13.09.2006 г.
Одним из важных принципов организации биосферы является взаимодействие между организмами разного уровня сложности. В популяциях дрозофил распространены вирусы (пикорновиру-сы), бактерии (Wolbachia), многоклеточные (грибы, нематоды, клещи). Симбиоз между дрозофилой и другими связанными с ней видами имеет весь спектр взаимоотношений - от паразитизма до мутуализма.
Бактерии рода Wolbachia относятся к группе а-протеобактерий, классу Rickettsia и являются первичными эндосимбионтами широкого спектра видов членистоногих и видов нематод-филя-риид. Распространение Wolbachia в популяции вида-хозяина связывают с индукцией репродуктивных аномалий, таких как цитоплазматическая несовместимость, партеногенез, феминизация и андроцидоз.
Классификация Wolbachia основывается на сравнении нуклеотидной последовательности генов. В настоящее время для генотипирования Wolbachia, инфицирующих D. melanogaster, используется пять полиморфных маркёров: встройка в два локуса инсерционной последовательности IS5, различие в кратности повторов двух минисателлит-ных мотивов и инверсии. Анализ лабораторных линий и линий, выделенных из географически удаленных популяций D. melanogaster всего мира, позволил определить пять генотипов Wolbachia, два из которых - wMel и wMelCS - оказались широко распространенными, тогда как wMelCS2 обнаружился в Восточной Европе и Средней Азии, wMel2 - в Японии, а wMel3 - в одной линии, возник предположительно уже при культивировании в лаборатории [1].
Существует корреляция между инфицирован-ностью бактерией вида-хозяина и родословной митохондриальной ДНК. Поскольку передача
Институт цитологии и генетики
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Новосибирск
Wolbachia и митохондрий в поколениях вида-хозяина осуществляется через цитоплазму, то существует косвенное влияние бактерии на разнообразие, распространение и фиксацию новых вариантов митохондриальных гаплотипов [2, 3].
Для тех видов, у которых известны различные штаммы бактерий Wolbachia, возможно более детальное описание цитоплазматических компонентов генома, а именно описание цитотипов, включающих характеристику особи (или линии) по гапло-типу мтДНК хозяина и статуса инфицированности штамма/генотипа бактерии. Устойчивое существование определенных цитотипов было показано у ряда видов: комары Culex pipiens [4], муравьи Solenopsis invicta [5], некоторые дрозофилы группы melanogaster [б]. Однако для D. melanogaster корреляции между зараженностью Wolbachia и гаплотипом митохондриальной ДНК хозяина до сих пор не отмечалось [7].
Отсутствие корреляции между зараженностью Wolbachia и гаплотипом митохондриальной ДНК D. melanogaster может объясняться как мо-номорфностью Wolbachia по гену wsp, так и отсутствием или слабым проявлением цитоплазматиче-ской несовместимости. Установление цитотипов для модельного объекта D. melanogaster является важным шагом к пониманию и моделированию процессов наследования компонентов цитоплазма-тического генома в популяции, горизонтального переноса и реконструкции истории вида.
Поскольку данные по распространению Wolbachia в евразийских популяциях D. melanogaster крайне скудны, а по динамике инфицированности популяций данных нет вовсе, мы приводим оценку представленности первичного эндосимбионта Wolbachia в популяции D. melanogaster Умани (Украина) за 20-летний период. В нашей работе мы впервые охарактеризовали структуру популяции D. melanogaster по компонентам цитоплазмати-ческого генома, а также выявили наличие сопряженности между митотипами по гену первой субъединицы цитохромоксидазы С D. melanogaster и генотипами Wolbachia.
562
ИЛИНСКИЙ, ЗАХАРОВ
В работе анализировали изосамочьи линии D. melanogaster, полученные из популяции г. Умань (Украина) 1984, 1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1993, 2003 и 2004 гг. ДНК выделяли из 3-4 взрослых самок D. melanogaster по методике [8] с модификациями. Праймеры для идентификации генотипов Wolbachia - минисателлитные маркёры: VNTR-141 F: 5'-ggagtattattgatatgcg, R: 5'-gactaaaggttagttgcat; VN-TR-105 F: 5'-gcaattgaaaatgtggtgcc, R: 5'-atgacaccttact-taaccgtc; вставки инсерционной последовательности IS5 IS5-WD0516/7 F: 5'-ccatcaaggtctctttca, R: 5'-tgcaaggaaaactaaaccag; IS5-WD1310 F: 5'-ag-gagaactggtctacgc, R: 5'-tgttgctgagctttgct; инверсии WD0394-WD0541 F: 5'-gcttggaaggtatatggac, R: 5'-ggctaaaactataagtattg, F: 5'-aagtctgtcacggttgag, R: 5'-gtaaaagatgcagtaaagg. Праймеры к последовательностям генов Wolbachia wsp 81F: 5'-tggtccaataagtgat-gaagaaac, 691R: 5'-aaaaattaaacgctactcca и 16S rRNA 99F: 5'-ttgtagcctgctatggtataact, 994R: 5'-gaataggtatgattttcatgt, используемые для установления статуса зараженности D. melanogaster, и праймеры к col -гену первой субъединицы цитохромоксидазы С митохондриаль-ной ДНК, F: 5-ccagctggaggaggagatcc, R: 5'-ccag-taaataatgggtatcagtg.
Все реакции проводили на амплификаторе Eppendorf. Условия: 30 циклов; первичная денатурация 95°C 5 мин, затем 95°C 20 с в каждом цикле, элонгация 72°C 1 мин/1 т.п.н., отжиг праймеров к гену wsp 57°C 1 мин, мультипраймерная реакция wsp-col 56°C 1 мин и для остальных реакций 55°C 1 мин.
Для определения нуклеотидной последовательности участка гена первой субъединицы цитохромоксидазы С D. melanogaster ампликон размером 542 п.н. выделяли из агарозного геля, используя набор фирмы "Promega" (California, USA). Секвенирование проводили в Межинститутском центре секвенирования ДНК (СО РАН, г. Новосибирск) с использованием реактива Big Dye версии 3.1.
Анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью интернет-версий программ ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw), BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST).
Анализ 9 выборок изосамочьих линий D. melanogaster, полученных на основе сборов 20-летнего периода из природной популяции Умань (Украина), включал 144 линии, из них зараженными оказались 54 линии (37.5%). Эндосимбионт Wolbachia обнаружился в цитоплазме мух в выборках всех лет исследования. Концентрация инфицированных мух в популяции Умань в разные годы варьировала от 15 до 70%, т.е. среди изученных нами 9 выборок не было обнаружено как свободных от Wolbachia, так и тотально зараженных. Здесь следует отметить, что зафиксированные уровни ин-фицированности могут отражать ее нижнюю границу, поскольку, строго говоря, нельзя исклю-
чить возможности потери некоторыми линиями эндосимбионта в ходе содержания изосамочьих линий в лабораторных условиях. Однако следует подчеркнуть, что нами не отмечено какой-либо корреляции уровня инфицированности линий со временем содержания линий в лаборатории (или равно как наличия ярко выраженной временн0й динамики).
Из 54 инфицированных линий 53 линии (98%) оказались носителями генотипа Wolbachia wMel и только 1 линия была выявлена как носитель генотипа Wolbachia wMelCS2. В представлении строгой передачи эндосимбионта Wolbachia по материнской линии и соответственно параллельного ее наследования вместе с митохондриями D. melanogaster мы попытались описать полиморфизм мтДНК в соответствии с различиями статуса инфицированности -по присутствию Wolbachia (есть/нет) и носителями разных генотипов Wolbachia (wMel/wMelCS2).
Мы секвенировали последовательность мтДНК гена первой субъединицы цитохромоксидазы С (col) размером 499 п.н. из района 2151-2649 относительно аннотированной последовательности полного генома мтДНК линии Oregon R - AN:AF200828 как неинфицированных, так и инфицированных изосамочьих линий D. melanogaster из популяции Умани, относящихся к периоду с 1984 по 2004 гг., а также различающихся по генотипу Wolbachia. В исследованных линиях из природной популяции D. melanogaster Умани нами были обнаружены два полиморфных сайта митохондриального генома D. melanogaster относительно аннотированной последовательности полного генома мито-хондриальной ДНК линии Oregon R - GenBank AN:AF200828; позиции замены нуклеотидов 2160 (С/T) и 2187 (C/T).
Из 32 секвенированных изосамочьих линий D. melanogaster Умани для 28 нами был установлен митотип "CT" (2160 C, 2187 T), который идентичен по анализируемому участку с аннотированными последовательностями полного генома мтДНК AF200829 (Zimbabwe 52) и AJ400907; для двух линий - митотип "TC", идентичный AF200828 (Oregon R), и для двух линий был установлен впервые описываемый нами митотип "CC" (табл. 1).
При сравнении статуса зараженности и при ге-нотипировании зараженных изосамочьих линий D. melanogaster обнаружилось, что все инфицированные wMel-Wolbachia линии, а также 14 из 17 незараженных линий определялись как митотип CT. Митотип TC обнаружен только у двух неинфицированных линий, совпадает с аннотированной по этому участку последовательностью AF200828, принадлежащей линии Oregon R, цитоплазма которой, по литературным источникам [1], может нести wMelCS-Wolbachia.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИНФИЦИРОВАННОСТИ
563
Отметим обнаруженную особенность нового, описанного нами, митотипа CC мтДНК, которая проявилась в его сопряженности с определенным генотипом Wolbachia, а именно с генотипом wMelCS2. Для подтверждения неслучайности этой сопряженности мы дополнительно секвени-ровали ген первой субъединицы цитохромоксида-зы С двух инфицированных wMelCS2-Wolbachia линий D. melanogaster из сборов других регионов (Гомель 1980, Кишинев 1984). И для этих двух линий также был установлен митотип СС, что подтверждает наличие сопряженности.
Таким образом, мы можем констатировать, что в течение 20-летнего периода (1984-2004 гг.) в популяции D. melanogaster Умани устойчиво существует эндосимбиотическая бактерия Wolba-chia генотипа wMel. Уровень инфицированности D. melanogaster варьировал от 15 до 70%. Наряду с этим в популяции D. melanogaster Умани была выявлена Wolbachia генотипа wMelCS2. Один из трех определенных нами митотипов мтДНК по гену пер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.