МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 56-62
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22;577.35
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ПАРАМАГНИТНЫХ ЦЕНТРОВ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РИБОНУКЛЕАЗЫ BACILLUS PUMILUS
© 2014 г. П. В. Зеленихин1, А. В. Макеева, А. П. Ложкин, А. А. Родионов, T. Н. Нгуен, О. Н. Ильинская
Казанский (Приволжский) федеральный университет Поступила в редакцию 06.06.2013 г.
Перспектива использования цитотоксичной рибонуклеазы Bacillus pumilus (биназы), индуцирующей избирательную гибель опухолевых клеток, обусловливает интерес к ее биологическим эффектам в отношении нормальной микрофлоры человека. С помощью проточной цитометрии установлено, что биназа в концентрации, вызывающей апоптоз раковых клеток, не влияет на жизнеспособность Escherichia coli K12. Впервые методом ЭПР-спектроскопии зарегистрированы изменения парамагнитных центров клеток E. coli K12 под действием биназы в нетоксичных концентрациях: повышение интенсивности ЭПР-сигналов, характерных для железосодержащих белков, в том числе, Fe—S кластеров, усиление интенсивности спектра сверхтонкой структуры двухвалентного марганца. С применением спинового зонда ТМТН ^-(1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпипередин-4-ил-)-2-ме-тилпропанамид гидрохлорида) зафиксировано двукратное повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках, провоцирующее окислительный стресс у бактерий, обработанных ферментом. Методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой продемонстрировано увеличение содержания в клетках щелочных (Li, Na, K), щелочноземельных (Mg, Ca), переходных (Cr, Mn, Fe, Cu, Zn) и постпереходных (Bi, Pb) металлов. Особого внимания заслуживают данные по возрастанию содержания Cu и Zn, нарушающих функции ферментов дыхательной цепи, и Mn, известного как кофактор супероксид дисмутазы, подтверждающие развитие окислительного стресса у бактерий.
Ключевые слова: цитотоксичные рибонуклеазы, Bacillus pumilus, биназа, кишечная микрофлора, ЭПР, АФК, окислительный стресс, переходные металлы.
DOI: 10.7868/S0026365614010170
Рибонуклеазы (РНКазы) бактерий обладают широким спектром биологической активности
[1]. Секретируемые РНКазы бактерий влияют на метаболизм самих прокариотических организмов
[2] и опосредуют ряд реакций у эукариот [3]. Известна способность микробных РНКаз, в частности РНКазы Bacilluspumilis 3-19 (биназы), индуцировать избирательную апоптотическую гибель опухолевых клеток, не оказывая воздействия на немалигнизированные клетки [4]. Потенциал биназы как средства химиотерапии злокачественных новообразований, в том числе и опухолей разных отделов кишечника, ставит вопрос о ее биологических эффектах в отношении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Ранее показано, что биназа в отношении микроорганизмов способна в низких концентрациях проявлять стимулируюшее, а в высоких, порядка 1 мг/мл, — ингибирующее действие [5]. Диапазон концентраций, эффективно индуцирующих апоптоз опухо-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: Pavel.Zelenikhin@kpfu.ru).
левых клеток, лежит в интервале 0.10—0.75 мг/мл [6, 7]. Эти концентрации не влияют на рост бактерий, но могут вызывать скрытые до определенного момента изменения различных параметров жизнедеятельности микробных клеток. Ферментные комплексы электрон-транспортных цепей, расположенные в цитоплазматической мембране бактерий, способны откликаться на самые незначительные изменения окружающей среды [8]. Эффективно характеризовать состояние этих комплексов позволяет ЭПР-спектроскопия, детектирующая качественный и количественный состав парамагнитных центров в составе электрон-транспортных цепей как в цитоплазмати-ческой мембране бактерий, так и в мембранах хлоропластов и митохондрий эукариот [9].
Цель настоящей работы — выявить изменения функционального состояния клеток Escherichia coli K12 под действием рибонуклеазы Bacillus pumilis 3-19 в концентрациях, не вызывающих токсического и рост-стимулирующего эффектов у
бактерий, с помощью ряда методов физико-химического анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фермент. В работе использована биназа, гуа-нил-специфичная РНКаза Bacillus pumilus 3-19 дикого типа (EC 3.1.27.3, молекулярная масса 12.3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9.5), изолированная как гомогенный белок из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21, несущего плазмиду pGEMGX1/ent/Bi [10].
Среды и условия культивирования. В качестве тест-объекта использовали стрептомицинустой-чивый штамм E. coli К-12 (ВКПМ-3254), который культивировали в LB-бульоне в присутствии стрептомицина (100 мкг/мл) при 37° С в течение 18 ч. Затем культуру использовали как инокулят, перенося в свежую питательную среду (конечная концентрация клеток 1 х 106), инкубировали 24 ч при 37°С в присутствии биназы (100 и 300 мкг/мл) либо без нее, клетки осаждали центрифугированием (2600 g, 20 мин), затем ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере (PBS, "Sigma", США), доводили их концентрацию до 3 х 109 КОЕ/мл и использовали для подготовки проб для ЭПР-анализа.
Цитофлуориметрический анализ жизнеспособности E. coli К12. 24-часовые культуры E. coli K12, выросшие в LB-бульоне, содержащем биназу, либо без нее, как описано выше, центрифугировали (2600 g, 20 мин). Затем клетки отмывали охлажденным натрий-фосфатным буфером ("Sigma", США) и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCanto II (BD, США), определяя изменение жизнеспособности клеток E. coli K12 при их окрашивании йодидом пропи-дия (PI), согласно [11].
ЭПР характеристика парамагнитных центров в клетках E. coli К12. ЭПР характеристики клеток, инкубированных с биназой, определяли на стационарном спектрометре ESP-300 ("Bruker", Германия) с рабочей частотой 9.4—9.9 ГГц, при напряженности магнитного поля 20—1600 мТ (погрешность — не более 0.01 мТ), частоте модуляции 100 кГц при мощности СВЧ-излуче-ния 2—20 мВт, с использованием капилляров объемом 25 мкл ("Sigma", США). Образцы для эксперимента подготавливали в двух видах — замороженные при 77 К и лиофилизированные. Клетки лиофилизировали на сушке Martin Christ (Германия) при температуре —76°С и давлении 0.001 Бар до полного высушивания. В качестве контролей использовали биомассу бактерий, выращенных на среде без добавления биназы, надосадочную жидкость и натрий-фосфатный буфер ("Sigma", США). Спектры замороженных образцов регистрировали при 77 К. Лиофилизированные образцы исследовали при 15 К с помощью гелиевого
проточного криостата Oxford-9 (Великобритания), контроль температуры осуществляли с применением прибора ITC 4 Oxford (Великобритания).
Для определения активных форм кислорода (АФК) использовали спиновый зонд — циклический гидроксиламин М-(1-гидрокси-2,2,6,6-тетра-метилпипередин-4-ил-)-2-метилпропанамид гидрохлорид (TMTH) (Институт органической химии, Новосибирск), аналогичный широко применяющимся зондам для определения супероксида по генерации стабильного нитроксильного радикала [12]. В 1 мл суспензии E. coli К12 (1 х 107 кл/мл) вносили 1 мМ TMTH, спектры ЭПР регистрировали при комнатной температуре (25°C), мощности СВЧ излучения 1 мВт, на частоте 9.72 ГГц, амплитуде высокочастотной модуляции 0.3 Гаусс, с использованием капилляров объемом 25 мкл.
Определение содержания металлов в клетках E. coli К12. Количественное определение металлов проводили в соответствии со стандартами РФ согласно методическим указаниям [13]. Измерения осуществляли на масс-спектрометре Elan DRC II ("Perkin Elmer", США), образцы предварительно подвергали микроволновой подготовке в системе MWS-3 ("Berghof", Германия) при температуре 150°С, в присутствии азотной кислоты и бидистиллированной воды.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Цитофлуориметрическая оценка жизнеспособности клеток E. coli К12. Анализ жизнеспособности E. coli К12 показал, что биназа в концентрации, цитотоксической для малигнизированных клеток эукариот, не приводила к гибели бактерий. Доля нежизнеспособных клеток с компрометированной мембраной в вариантах с обработкой биназой составила 5.9 и 5.4% для концентраций РНКазы 100 и 300 мкг/мл соответственно, и не имела достоверных различий с вариантом без внесения фермента.
ЭПР-спектроскопия образцов клеток E. coli
К12. В препаратах клеток E. coli К12 было обнаружено несколько различных типов ЭПР-сигналов. Первый тип зарегистрирован в замороженных образцах при g = 2.00, причем интенсивность данного сигнала в клетках, обработанных биназой, была выше, чем в необработанных клетках (рис. 1, I, II). Этот же сигнал, но большей интенсивности наблюдали в образцах лиофилизированных клеток, с той же тенденцией к росту интенсивности после обработки ферментом (рис. 1, III). Значения g и форма линии сигнала позволяют предположить, что источником сигнала является радикал, содержащий серу [14].
Второй тип сигнала зарегистрирован при g = 3.00, его интенсивность не зависела от обработки клеток E. coli К12 биназой (рис. 1, I).
ть
с о н
<ч
и с н е т н И
g = 3.00
g = 2.00 /
g = 2.00
/
А
Б
Рис. 1. Спектры ЭПР клеток E. coli К12 (СВ частота 9.63 ГГц, мощность СВЧ 20 мВт): I — спектры ЭПР замороженных клеток в широком диапазоне магнитных полей при 77 К, II — спектры ЭПР замороженных клеток в области магнитных полей вблизи g = 2 при 77 К, III — спектры ЭПР лиофилизированных клеток в широком диапазоне магнитных полей при 15 К, IV — спектры ЭПР клеток, отрицательного контроля и супернатантов. А — клетки бактерий, обработанные биназой (300 мкг/мл, 24 ч), Б — клетки бактерий без обработки, В — натрий-фосфатный буфер, Г — супер-натант после осаждения клеток, инкубированных с биназой, Д — супернатант после осаждения необработанных клеток.
1000 2000 3000 4000 5000 6000
ть
с о н
<ч
и с н те
н И
II А
[\\ g = 2.00 g = 1.93 / / ' ' Б
Y
1 1 1 1 1 1 1 1 1
3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 3800 3900
ть
с о н
rn
и с н те
н И
ть
с о н
m
и с н те
н И
g = 5.84 g = 4.27
А
Б
1000 2000 3000 4000 5000 6000
Б
В
Г
IV "-■■■-.. Д
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Напряженность магнитного поля, Гаусс
Третий тип сигнала, присутствующий в спектрах, характеризовался g = 1.93. Сигнал хорошо различим при малой развертке магнитно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.