БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 12, с. 1683 - 1690
УДК 577.152.1
ХАРАКТЕРИСТИКА КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГИДРОГЕНАЗЫ, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ аоеоеарБа а\р1со1а CALU 743
© 2006 г. Л.Т. Серебрякова*, М.Е. Шереметьева
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142292 Пущино Московской области, ул. Институтская, 2; факс: (4967)330-552, электронная почта: sereb@issp.serpukhov.su
Поступила в редакцию 06.07.06 После доработки 11.10.06
Изучены основные каталитические свойства гидрогеназы типа Нох, выделенной из клеток Gloeocapsa а1р^ со1а. Фермент эффективно катализирует реакции окисления и образования Н2 в присутствии метилвиоло-гена (МВ) и бензилвиологена (БВ). Скорости этих реакций при взаимодействии с физиологическим донором/акцептором электронов, МАВН/ЫАО+, составляют лишь 3—8% от МВ(БВ)-зависимых значений. Фермент взаимодействует с МАОР+ и МАОРН, но более специфичен к МАО+ и МАОН. Установлено, что очистка гидрогеназы сопровождается разрушением ее мультимерной структуры и утратой способности взаимодействовать с пиридиннуклеотидами при сохранении активности гидрогеназного компонента (НохУН). Для проявления каталитической активности фермент нуждается в восстановительной активации, которая осуществляется в присутствии Н2, причем МАОН ускоряет этот процесс. Показано, что конечный уровень активности гидрогеназы зависит от редокс-потенциала активационной среды (Еь). При рН 7,0 активность в реакции МВ-зависимого окисления Н2 увеличивалась по мере снижения Еь от —350 мВ и достигала максимума при Еь около —390 мВ. В то же время скорость окисления Н2 в присутствии МАО+ в исследуемом диапазоне Еь оставалась практически постоянной и составляла 7—8% от максимальной скорости окисления Н2 в присутствии МВ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цианобактерия, гидрогеназа Нох типа, гидрогеназная активность, диафоразная активность, восстановительная активация.
Цианобактерии способны синтезировать две функционально различные гидрогеназы [1—3]. Одной из них является мембраносвязанная Ni-Fe-гидрогеназа поглощающего типа (HupSL), характерная для азотфиксирующих видов. Функция этого фермента состоит в реутилизации Н2, выделяемого нитрогеназой [4, 5].
Вторая гидрогеназа катализирует in vitro как выделение, так и поглощение Н2 при взаимодействии с искусственными донорами или акцепторами электронов и поэтому названа обратимой. Обратимая гидрогеназа обнаружена у разных форм цианобактерий и, по-видимому, является единственным ферментом, ответ-
Принятые сокращения: ЭТЦ — электрон-транспортная цепь; ФС11 - фотосистема 2; МВ, МВ2+, МВ+ - ме-тилвиологен, его окисленная и восстановленная формы; БВ, БВ2+, БВ + - бензилвиологен, его окисленная и восстановленная формы; ДТ — дитионит натрия; Еь — редокс-по-тенциал или окислительно-восстановительный потенциал среды.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ственным за физиологические реакции метаболизма водорода, у штаммов, неспособных к фиксации молекулярного азота [6—8]. Молеку-лярно биологические свойства фермента детально изучены: идентифицированы и полностью секвенированы структурные гены (ЫхЕВиУН), кодирующие обратимую гидроге-назу у относительно большого числа цианобак-терий [9—11]. НохУН представляет собой гидро-геназный димер, несущий биметаллический №-Бе-активный центр. НохЕБи — диафоразная часть фермента, ответственная за его взаимодействие с МАБ(Р)+/МАБ(Р)Н. Несмотря на многочисленные данные по молекулярной биологии обратимой гидрогеназы, ее функциональная роль в метаболизме цианобактерий до сих пор остается предметом дискуссий. На основании высокой степени гомологии диафоразных субъединиц гидрогеназы с тремя субъединицами дыхательного МАОН-дегидрогеназного комплекса предполагается, что диафоразная часть гидрогеназы одновременно является МАБН-окисляющей частью этого комплекса, функцио-
1683
7*
нирующего как в фотосинтетической, так и в дыхательной ЭТЦ [9, 12, 13]. В свете данного предположения физиологическая роль обратимой гидрогеназы у цианобактерий может рассматриваться как «клапан» для сброса избытка восстановительных эквивалентов из ЭТЦ в виде Н2 [13, 14].
В течение ряда лет нами изучается метаболизм водорода у одноклеточной неазотфиксиру-ющей цианобактерии Gloeocapsa alpicola CALU 743. Этот микроорганизм способен выделять и поглощать молекулярный водород за счет функционирования в клетках обратимой гидрогена-зы — гидрогеназы типа Hox [15, 16]. Так, Н2 наряду с ацетатом и СО2 является основным продуктом сбраживания гликогена, накапливаемого клетками при фотосинтезе [17, 18]. Н2 интенсивно окисляется гидрогеназой в фотосинтези-рующих клетках и может являться единственным донором электронов при аноксигенном фотосинтезе [18, 19]. Мы обнаружили, что синтез гидрогеназы не регулируется на транскрипционном уровне, хотя гидрогеназная активность клеток возрастает в несколько раз при росте культур в условиях лимитирования азотом (нитратом), когда наблюдается инактивация ФС11 и внутриклеточная среда становится более восстановленной [15, 16]. Высокая чувствительность обратимой гидрогеназы к кислороду в значительной степени затрудняет очистку фермента и изучение его in vitro. Наиболее детально охарактеризованы обратимые гидрогеназы одноклеточных цианобактерий Synechocystis sp.PCC 6803 и Anacystis nidulans, выделенные и очищенные в анаэробном боксе [11]. Данных относительно каталитических свойств фермента немного, они фрагментарны и часто противоречивы.
В настоящей работе представлены результаты исследования каталитического поведения гидрогеназы G. alpicola в изолированном состоянии: ее стабильность и активация, оптимальные условия катализа выделения и окисления Н2 при взаимодействии с искусственными и физиологическими донорами и акцепторами электронов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гидрогеназа была выделена из клеток Gloeocapsa alpicola CALU 743, штамм Fitzgerald 1051, культивирование которых проводили в периодическом режиме на среде BG0 [20] с добавлением лимитирующих рост концентраций нитрата (2-4 мМ) [18].
Гидрогеназную активность клеток и препаратов при очистке фермента определяли в реак-
ции выделения Н2 из МВ+, восстановленного ДТ, амперометрическим методом [18] и выражали в мкмоль/мин на 1 мг белка. Выделение и поглощение Н2, катализируемое гидрогеназой при взаимодействии с разными донорами и акцепторами электронов, измеряли, спектрофото-метрическим [21, 22] и амперометрическим [18] методами и выражали в мкмоль/мин на 1 мл или в мкмоль/мин на 1 мг белка. В расчетах использовали следующие значения молярного коэффициента поглощения: в600 12 300 М-1 см-1 для МВ, в555 7 5 5 0 М-1 см-1 для БВ и в340 6300 М-1 см-1 для МАОН. Измерение рН зависимости активности гидрогеназы проводили в 20 мМ цитрат-фосфатном (рН 3,0-7,5) и глицин-фосфатном (рН 6,5-10,5) буферах. В кислых реакционных средах (рН <6,0) вместо ДТ для восстановления МВ использовали металлический цинк.
Восстановительную активацию гидрогеназы проводили в стеклянных сосудиках (20 мл) с боковыми отростками, в которые помещали препарат гидрогеназы (~1-3 мг белка/мл), и заменяли газовую фазу сосудика на Аг или Н2 путем многократного вакуумирования-заполнения. Для удаления следов кислорода и контроля анаэробной среды в центральную часть сосудика помещали 1 мл 2 мМ раствора МВ, восстановленного ДТ. Необходимые добавки вводили в препарат гидрогеназы микрошприцем. Отбор образцов также осуществляли микрошприцем и анаэробно переносили в реакционную систему.
Для очистки гидрогеназы использовали нит-рат-лимитированные клетки цианобактерии, обладающие высокой гидрогеназной активностью и низким содержанием фикобилиновых пигментов. Суспензию клеток в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) обрабатывали ультразвуком при постоянном охлаждении и центрифугировали гомогенат 40 мин при 14 000 g. Супернатант - бесклеточный экстракт - подвергали ступенчатой хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой ОЕ52 (3 х 15 см), которую промывали 0,05 М калий-фосфатным буфером, затем 0,1 М раствором МаС1 в этом же буфере, а гидрогеназу элюировали 0,5 М МаС1 в том же буфере. В полученной фракции сохранялось 100% гидрогеназной активности бесклеточного экстракта. К этой фракции добавляли (МН4)2804 до концентрации 0,6 М и наносили на колонку (1 х 5 см) с фенил-сефарозой СЬ 4В, уравновешенной 0,8 М (МН4)2804. Колонку промывали 0,25 М (МН4)2804 и элюировали гидрогеназу 0,05 М калий-фосфатным буфером (рН 7,0). Полученный препарат хроматографировали на колонке (1 х 10 см) с Бгас1^е1 БЕАЕ 650 (8). Элю-ирование белков осуществляли линейным градиентом концентраций МаС1 (0,1-0,8 М) в 0,05 М
калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Центральные фракции с гидрогеназной активностью объединяли, концентрировали на маленькой колонке (0,3 х 2 см) с ДЭАЭ-целлюлозой DE52 и подвергали гель-фильтрации на колонке (1 х 100 см) с сефакрилом S-300, уравновешенной 0,05 M Tris-HCl-буфером (рН 8,0), содержавшем 0,1 М NaCl.
Электрофорез препаратов гидрогеназы проводили в неденатурирующих условиях в 7,5% ПААГ [23] и проявляли зоны активности, инкубируя гели в 0,025 M Tris-HCl-буфере (рН 8,0), содержавшем 1 мМ МВ, в атмосфере Н2 при 30°.
Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд [24].
В работе использовали Tris, МВ, БВ, NAD+, NADH, NADP+, NADPH и ДТ фирмы «Serva» (Германия), ДЭАЭ-целлюлозу DE52, фенил-се-фарозу CL-4B и сефакрил S-300 фирмы «Pharmacia» (Швеция), Fractogel DEAE 650 (S) фирмы «Merck» (Германия), остальные реактивы — отечественного производства квалификации х.ч. и ос.ч.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Очистка гидрогеназы. Процедуру очистки гидрогеназы осуществляли в аэробных условиях с использованием четырех колоночных хрома-тографий (табл. 1). Препарат с максимальной удельной активностью, 32 мкмоль Н2/мин на 1 мг белка, получен на стадии градиентной хроматографии на колонке с Ргас1^е1 ОЕАЕ. Гель-фильтрация этого препарата приводила к резкому снижению активности и стабильности гидро-геназы и утрате ею способности взаимодействовать с МАО(Р)+ и МАО(Р)Н. Молекулярная мас-
са гидрогеназы, оцененная гель-фильтрацией конечного препарата на калиброванной колонке с сефакрилом 8-300,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.