УДК 577.35
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ МИКРОДОМЕНОВ (РАФТОВ) ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ
© 2014 г. И. С. Нестёркина1, Н. В. Озолина1*, В. Н. Нурминский1, А. Л. Ракевич2, Е. В. Колесникова1, Н. В. Семёнова1, Р. К. Саляев1
1Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, ул. Лермонтова, 132, 664033, Иркутск;
*электронная почта: ozol@sifibr.irk.ru 2Иркутский филиал Института лазерной физики СО РАН, ул. Лермонтова, 130а, 664033, Иркутск
Поступила в редакцию 18.04.2014 г.
Мембраны клеток структурно неоднородны и содержат липид-белковые микродомены (рафты), в которых протекают сигнальные и транспортные процессы. Организация и свойства рафтов в растительных клетках изучены недостаточно. В данной работе исследовались рафты вакуолярной мембраны клеток корнеплодов столовой свеклы. Рафт-содержащие фракции мембран выделяли детер-гентным и бездетергентным методами. С помощью спектроскопических и хроматографических методов определено общее содержание белков, липидов и насыщенных жирных кислот. Степень упорядоченности липидной фазы оценивали с использованием флуоресцентного зонда лаурдана и конфокальной микроскопии. Показано, что бездетергентные препараты содержат значительно больше белков, примерно то же количество липидов и меньше насыщенных жирных кислот, чем рафты, выделенные с использованием Тритона Х-100. Упорядоченность липидной фазы была выше в рафтах, выделенных с Тритоном Х-100. Таким образом, примененные методические подходы позволяют выделять рафты из вакуолярной мембраны, оценивать их физико-химические свойства и выявлять различия характеристик препаратов, полученных разными методами.
Ключевые слова: вакуолярная мембрана, липид-белковые микродомены, рафты, флуоресцентные зонды, конфокальная микроскопия.
Б01: 10.7868/80233475514050065
ВВЕДЕНИЕ
Исследования биологических мембран показали, что клеточные мембраны являются неоднородными структурами и содержат так называемые рафты [1—3], представляющие собой микродомены липидного бислоя, в которых образуются области с более плотной упаковкой молекул липи-дов вокруг определенных белков. Эти области обогащены гликосфинголипидами, стеринами и липидами с насыщенными жирными кислотами. Белковая часть рафтов представлена аквапорина-ми, АТР-азами, кавеолином, О-белками, проте-инкиназами [4, 5]. Рафты отличаются от основной части мембраны как по биохимическому составу, так и по выполняемым функциям [6, 7]. Большой интерес к рафтам связан с их активным участием во многих жизненно важных процессах, таких как эндоцитоз, внутриклеточная передача сигналов, сортировка и доставка белков и др. [7, 8]. В настоящее время рафты обнаружены в плазматической мембране [9, 10], мембранах эн-доплазматического ретикулума, аппарата Гольд-жи [11—14] и митохондрий [15]. Изучение рафтов
в клеточных мембранах растений, в основном в плазмалемме, началось сравнительно недавно. Нами впервые показано присутствие рафтов в вакуолярной мембране и частично охарактеризован их липидный состав [16]. Наиболее распространен детергентный способ выделения этих микродоменов [10, 17], но в настоящее время большая часть исследователей [18, 19] считает, что необходимо использовать более мягкие подходы [20]. Целью нашего исследования было сравнительное изучение биохимических характеристик липид-белковых микродоменов, выделенных детергент-ным и бездетергентным методами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили вакуолярные мембраны клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо, выращенной на опытном участке института. Использовали корнеплоды, находящиеся в стадии покоя, которые хранили в овощехранилище при 4°С. Вакуоляр-ные мембраны получали методом, описанным в [21]. Использованные критерии оценки чистоты
А. Состав буфера:
1% Тритон Х-100, 50 мМ Трис-HCl, 3 мМ EDTA,1 мМ PMSF, рН 7.5. Перемешивание на шейкере при 4°С, 30 мин
Б. Состав буфера:
20 мМ Трис-НС1, 1 мМ мбс12, 1 мМ СаС12, ингибиторный коктейль, рН 7.8. Перемешивание на шейкере при 4°С, 30 мин. Пропускание через шприц
Сахарозный градиент 60—15 %, Центрифугирование при 200 000 g, 18 ч
%
15 25 35 45
60
Липид-белковые микродомены
Идентификация белков
Идентификация липидов
Рис. 1. Схема получения липид-белковых микродоменов из вакуолярной мембраны детергентным (А) и бездетергент-ным (Б) методами.
изолированных мембран по ферментам-маркерам приведены в [16]. Липид-белковые микродомены выделяли двумя методами (рис. 1). Первый заключался в том, что детергент-устойчивые фракции тонопласта, которые относят к рафтам, выделяли центрифугированием (200000 g, 18 ч, ультрацентрифуга Sorvall Discovery 90SE, Япония) в градиенте сахарозы 15—60% после предварительной солюбилизации вакуолярных мембран 1% Тритоном Х-100 в течение 30 мин при 4°C в шейкере по модифицированной методике Mon-grand et al. [17]. Схема второго, бездетергентного, метода выделения рафтов, как и первого, приведена на рис. 1. В этих экспериментах были использованы подходы, предложенные Macdonald и Pike [20]. Ингибиторный коктейль содержал следующие компоненты: 0.2 мМ 4-(2-аминоэтил)бензенсульфонил-гидрохлорид, 1 мг/мл апротинина, 10 мкМ бес-татингидрохлорид, 3 мкМ E-64, 10 мг/мл
гидрохлорида леупептина, 2 мкМ пепстатин. Для характеристики выделенных микродоменов использовали опалесцирующую зону [10], которая как при детергентном, так и при бездетергентном способе выделения находилась в области 25% сахарозы (рис. 1). Количество наносимого на сахарозный градиент тонопласта контролировали по содержанию белка, который определяли по методу Бредфорд [22]. Материал, полученный после высокоскоростного центрифугирования, делили на зоны. В зонах опалесценции, содержащих ли-пид-белковые микродомены, содержание белка также определяли по методу Бредфорд [22].
Из этих зон экстрагировали липиды по методу Блая и Дайера [23] и определяли их содержание гравиметрическим методом [24]. Экстрагированные липиды использовали в экспериментах по изучению жирнокислотного состава липидов тонопласта и рафтов, выделенных детергентным и
Содержание липидов, % 10 8 6 4 2
0 I—
С детергентом
Без детергента
Рис. 2. Содержание липидов в липид-белковых микродоменах, выделенных детергентным и бездетер-гентным методами из тонопласта. За 100% принято содержание липидов в тонопласте, из которого извлекали микродомены. Экстракцию липидов из зон опа-лесценции проводили по методу [22]. Вес липидов определяли гравиметрическим методом [24].
Содержание белка, %
20 15 10 5
0
С детергентом
Без детергента
Рис. 3. Содержание белка в липид-белковых микродоменах, выделенных детергентным и бездетергент-ным методами из тонопласта. За 100% принято содержание белка в тонопласте, из которого извлекали микродомены. Содержание белка в зонах опалесцен-ции определяли по методу [26].
бездетергентным способом. Для получения метиловых эфиров жирных кислот к экстракту липидов после упаривания добавляли 1% H2SO4 в метаноле. Полученную смесь нагревали на водяной бане при температуре 55°C в течение 30 мин. После охлаждения метиловые эфиры жирных кислот трижды экстрагировали гексаном. Экстракт концентрировали в токе аргона [25]. Далее метиловые эфиры жирных кислот липидов тонопласта и микродоменов анализировали на хромато-масс-спектрометре 5973 N/6890N MSD 6890N (Agilent Technology, США). Для разделения использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX (30 м х 250 мкм х 0.50 мкм). Неподвижная фаза — полиэтиленгликоль. Подвижная фаза — гелий; скорость потока газа — 1 мл/мин. Температура испарителя 250°С, источника ионов — 230°С, детектора — 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром — 280°С. Хроматографирование проводили в изократиче-ском режиме при 200°С. Для идентификации пиков метиловых эфиров жирных кислот использовали значение времени удерживания стандартов и индекс эквивалентной длины алифатической цепи (ECL) [26].
Для получения ИК-спектров микродомены из зон опалесценции, полученных после высокоскоростного центрифугирования, освобождали от сахарозы центрифугированием в течение 90 мин при 105000 g на препаративной центрифуге Sorvall Discovery 90SE (Япония). Затем суспензию везикул тонопласта и суспензию изолированных микродоменов наносили равномерным слоем на оптическую пластинку KRS-5 (TIJ-TIBr). После высушивания в эксикаторе над прокаленным CaCl2 записывали спектры на ИК-спектрофото-метре F^R Spectrum One (Perkin Elmer, США).
Фазовое состояние бислоя мембран изолированных вакуолей и липид-белковых микродоменов изучали на конфокальном люминесцентном сканирующем лазерном микроскопе с пикосе-
кундным временным разрешением MicroTime 200 (PicoQuant GmbH, Германия). В качестве зонда был использован лаурдан ( Laurdan, 2-(dimethy-lamino)-6-dodecanoylnaphthalene, Sigma-Aldrich). Для связывания зонда с вакуолярной мембраной к суспензии изолированных вакуолей и к фракциям липид-белковых микродоменов добавляли лаурдан, растворенный в метаноле, до конечной концентрации 10 мкМ. Суспензию инкубировали при 20 ± 2°C в течение 10 мин. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе. Рассчитывали величину генерализованной поляризации для каждого пикселя полученного изображения вакуолярной мембраны и выделенных микродоменов. При сканировании на конфокальном микроскопе фракции рафтов в растворе регистрировались только треки. По величинам генерализованной поляризации рассчитывали среднее ее значение и стандартное отклонение.
В работе применяли следующие реактивы фирмы Sigma: 2^-морфолино-этансульфоно-вую кислоту (МЭС), Трис, 2-меркаптоэтанол, лаурдан, 4-(2-аминоэтил)бензенсульфонилгидро-хлорид, Е-64, леупептингидрохлорид, бестанин-гидрохлорид. Реактивы фирмы Fluka: пепстатин А, апротинин. Остальные реактивы были отечественного производства квалификации х. ч.
На графиках представлены средние арифметические значения величин и их стандартные отклонения, полученные в пяти независимых экспериментах и подсчитанные с помощью программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе определяли содержание белков и липидов в липид-белковых микродоменах, выделен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.