УДК 577.352:577.115
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПИДОВ МИКРОДОМЕНОВ ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ
© 2015 г. И. С. Нестёркина, Н. В. Озолина*, В. Н. Нурминский, Е. В. Колесникова, Л. В. Дударева, Р. К. Саляев
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН; 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132;
*электронная почта: ozol@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 24.10.2014 г.
Присутствие липид-белковых микродоменов (рафтов) в биологических мембранах считается доказанным. Состав липидов и белков в них существенно зависит от природы мембраны и способа ее выделения. Проведен сравнительный анализ липидного состава микродоменов вакуолярной мембраны, выделенных детергентным и бездетергентным методами. Мембранные микродомены, выделенные с использованием детергентов, относятся к рафтовым структурам, которые в последнее время активно изучаются. Однако нативность этих структур вызывает большие сомнения, поэтому для выделения микродоменов был использован также более мягкий бездетергентный метод. Показано, что микродомены, выделенные из тонопласта без детергентов, по липидному составу существенно отличаются от выделенных с помощью Тритона Х-100. Это не позволяет отнести их к рафтам, несмотря на их расположение в той же опалесцирующей зоне сахарозного градиента, что и рафтов, выделенных с Тритоном Х-100. Известно, что отличительной особенностью рафтов является преобладание стеринов и сфинголипидов, однако во фракции микродоменов, выделенных без детергента, это не наблюдалось. Полученные результаты доказывают, что выделенные разными способами мембранные структуры в зависимости от наличия или отсутствия детергента представляют собой различные микродомены, которые могут иметь специфические функции.
Ключевые слова: вакуолярная мембрана, липид-белковые микродомены, рафты, мембранные липи-ды, стерины.
Б01: 10.7868/80233475515020085
По современным представлениям биологические мембраны содержат различные липид-белко-вые микродомены, которые отличаются по биохимическим характеристикам и выполняемым функциям. Наиболее изучены микродомены, для выделения которых используются детергенты. Они получили название рафтов. Отличительные особенности этих структур связаны с определенным биохимическим составом и биофизическими характеристиками. Классическое определение рафтов характеризует их как микродомены клеточных мембран, в которых вокруг определенных белков возникают обогащенные сфинголипидами и стери-нами области, где липиды находятся в жидко-упорядоченном фазовом состоянии [1, 2]. Это небольшие (10—200—500 нм) гетерогенные, высокодинамичные структуры, стабилизированные через белок-белковые и белок-липидные взаимодействия. Рафты, выделенные из разных мембран, могут отличаться по липидному и белковому составу [3, 4]. Повышенный интерес к изучению рафтов связан с тем, что они принимают активное участие в таких жизненно важных для метаболизма клетки процессах, как транспорт, внутриклеточная переда-
ча сигналов, эндоцитоз [5, 6]. На данный момент рафты обнаружены в плазматической мембране [7, 8], мембранах эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи [9, 10] и в мембранах митохондрий [11]. Впервые нами показано присутствие детергент-нерастворимых микродоменов в вакуолярной мембране [12]. Для выделения рафтов из мембран обычно используют детергентный метод с Тритоном Х-100 [10, 13], однако обнаружено, что детергенты существенно нарушают нативность выделенных микродоменов [14]. В настоящее время большая часть исследователей [15, 16] считает, что выделять рафты необходимо с помощью бездетер-гентных методов [17]. Цель представленной работы состояла в проведении сравнительного анализа ли-пидного состава микродоменов, выделенных из вакуолярной мембраны детергентным и бездетергент-ным методами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили вакуолярные мембраны клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо, выращенной на
Схема получения липид-белковых микродоменов из вакуолярной мембраны.
опытном участке института. В экспериментах использовали корнеплоды, находящиеся в стадии покоя, которые хранили при +4°С. Вакуолярные мембраны получали по методу [18]. Чистоту изолированных мембран оценивали с использованием ферментов-маркеров. Загрязнение фракции вакуолярных мембран плазматическими мембранами оценивали по активности ванадат-чувстви-
тельной АТР-азы, загрязнение мембранами митохондрий — по активности азид-чувствительной АТР-азы в сравнении с нитрат-чувствительной АТР-азой тонопласта. Определение АТР-азной активности подробно описано в [19]. Микродомены выделяли двумя методами (рисунок): с использованием Тритона Х-100 и без детергента. Де-тергентное выделение липид-белковых микродоме-
нов тонопласта проводили по модифицированному методу [13]. При бездетергентном способе выделения липид-белковых микродоменов был использован метод [17]. В обоих методах модификация состояла в изменении состава сахарозного градиента. В наших опытах в обоих вариантах проводили центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 15—60%. В работе [13] был использован градиент плотности сахарозы 5—52%, а в работе [17] градиент плотности OptiPrep 0—25%. При выделении микродоменов с Тритоном X-100 опалесци-рующая зона, в которой, по мнению ряда исследователей [8], расположены рафты, появлялась в области 25% сахарозы, тогда как при бездетер-гентном выделении зона опалесценции была более широкой и располагалась в области 25—30% сахарозы. Из зоны опалесценции липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол по методу [20] и разделяли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Подробная методика ТСХ приведена в работе [12]. Выявленные после соответствующего окрашивания [12] на пластинках ТСХ липиды сканировали (сканер HP LaserJet M1005 MFP), полученные файлы формата jpeg преобразовывали в файлы формата tiff и обрабатывали с помощью программы Scion Image версии beta 4.0.2. Состав стеринов в мембранных фракциях определяли методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра GC-MS 7000/7890A Triple Quad, Agilent Technologies (USA). Объем вводимой пробы — 0.02 мкл. Температура испарителя 250°С, источника ионов 230°С, детектора 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280°С. Диапазон сканирования 41—550 а. е. м. Для разделения компонентов использовали капиллярную колонку HP-5MS (30 м х 0.250 мм х 0.50 мкм), Agilent Technologies (США). Неподвижная фаза — 5%-фенилметилполисилоксан. Градиент температуры: 2 мин при 150°С, затем со скоростью 10°С/мин до 300°С, затем выдерживали в течение 15 мин при этой температуре. Подвижная фаза — гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Разделение потоков 5 : 1. Масс-спектрометр — квадруполь, способ ионизации — электронный удар (EI) (энергия ионизации: 70 эВ). Анализ проводили в режиме поиска отдельных ионов (SIM). Для идентификации фитостеринов использовали сравнение их времен удерживания с временами удерживания стандартов, а также библиотеки масс-спектров NIST08 и WILEY7.
В работе применяли следующие реактивы фирмы Sigma: 2-^морфолиноэтансульфоновую кислоту (МЭС), Трис, 2-меркаптоэтанол, Е-64, леупептин гидрохлорид, гидрохлорид бестанина, АТР (натриевая соль); реактивы фирмы Fluka: пепстатин А, апротинин; остальные реактивы были отечественного производства и имели квалификацию х. ч.
В таблицах представлены средние арифметические значения величин, полученные в пяти независимых экспериментах, и их стандартные отклонения, подсчитанные с помощью программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Чистоту вакуолярных мембран, выделенных из тканей корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris L., отслеживали по активности ферментов-маркеров. В изучаемой фракции ванадат (специфический ингибитор АТР-азы плазмалеммы) на 6% подавлял общую АТР-азную активность тонопласта, азид (специфический ингибитор мито-хондриальной АТР-азы) — на 14%, тогда как нитрат ионы — на 44%. Биохимическая характеристика мембранных микродоменов затруднена, так как их трудно получить в чистом виде [21]. Долгое время наиболее распространенный способ выделения мембранных микродоменов был связан с использованием детергентов [8, 13]. Однако вскоре было обнаружено, что детергенты очень сильно изменяют биохимический состав и структуру изучаемых объектов [22]. Таким образом, под большим вопросом оказалась нативность выделенных микродоменов и сама возможность их существования in vivo. Поэтому некоторые исследователи начали выделять рафтовые микродомены с использованием более мягких подходов [17]. Полной ясности в вопросе выбора наиболее предпочтительного способа выделения рафтов пока нет. Сравнение микродоменов, выделенных детергентным и бездетергентным методами, которое было проведено несколькими исследователями [15, 23], позволило сделать вывод, что и без детергентов выделялись рафты, поскольку они отвечали основным требованиям, предъявляемым к таким структурам: были значительно обогащены стеринами и сфинголипидами и обладали высокоупорядочен-ным фазовым состоянием. Эти исследования, как и результаты экспериментов на искусственных мембранах [24], доказывают существование раф-тов in vivo, которое оспаривается в работах некоторых исследователей [22, 25].
После выделения из вакуолярной мембраны липид-белковых микродоменов с помощью Тритона Х-100 [12] мы также выделили липид-белко-вые микродомены без использования детергента. Вакуолярные микродомены, полученные разными способами, отличались по биохимическим и биофизическим характеристикам [26]. Так, ли-пид-белковые микродомены, выделенные безде-тергентным методом, имели более высокое содержание белка, что было ожидаемо, поскольку применение Тритона Х-100 значительно обедняет белковую составляющую микродоменов. По количественному содержанию липидов микродомены, выделенные разными способами, не отлича-
Таблица 1. Полярные липиды тонопласта (I) и микродоменов тонопласта, полученных детергентным (II) и без-детергентным (III) методами
Класс липидов % от общего содержания полярных липидов
Тонопласт (I) Микродомены
с детергентом (II) без де
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.