ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.11.22
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА BUDVICIA AQUATICA DLR 20186
© 2014 г. Л. Д. Варбанец*, 1, Э. Л. Здоровенко**, О. С. Броварская*, С. И. Похил***
*Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАНУкраины, Киев **Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН ***Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины, Харьков
Поступила в редакцию 18.03.2013 г.
Выделен и изучен липополисахарид (ЛПС) Budvicia aquatica DRL 20186, проведена его химическая идентификация, показано, что он является малотоксичным, но высоко пирогенным. По составу жирных кислот он сходен с ЛПС других представителей Enterobacteriaceae: доминирующими являются тетрадекановая (32.7%) и 3-гидрокситетрадекановая (23.8%) кислоты. Выявлены также гекса-деценовая (20.4%), гексадекановая (11.8%) и додекановая (8.4%) кислоты. В реакциях двойной им-мунодиффузии в агаре по методу Оухтерлони показано, что ЛПС B. aquatica 20186 в гомологичной системе проявляет активность антигена. Однако в перекрестных серологических реакциях не взаимодействует с антисыворотками к представителям других штаммов B. aquatica.
Ключевые слова: Budvicia aquatica, липополисахарид, жирнокислотный состав, моносахаридный состав, биологическая активность.
DOI: 10.7868/S0026365614010169
Одними из первых микроорганизмов, которые стали предметом исследований ученых были представители энтеробактерий. Почему? А потому что они являются неотъемлемой составной частью биосферы и чрезвычайно широко распространены в объектах окружающей среды. Их жизнедеятельность, как раньше, так и сейчас существенно влияет на разные сферы деятельности людей. Несмотря на то, что Enterobacteriaceae является семейством микроорганизмов, которые наиболее изучены как фенотипически, так и ге-нотипически, его систематика и на сегодняшний день продолжает изменяться и усовершенствоваться. Это обусловлено разнообразием биологических свойств энтеробактерий, что значительно усложняет диагностику представителей этого семейства. При этом наибольшие трудности возникают при идентификации новых, впервые описанных и малоизученных видов, таких как Rah-nella aquatilis, Budvicia aquatica и Pragia fontium, которые характеризуются низким сродством с представителями основного рода — Escherichia. Так, сродство с ним родов Rahnella, Pragia и Budvicia составляет 16, 5 и 1% соответственно. Род Pragia наиболее сходен по строению генома с Budvicia (20—37% гомологии ДНК). Род Budvicia с единственным видом B. aquatica впервые был
1 Автор для корреспонденции (e-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua).
описан в 1983 г. в Чехословакии [1]. Бактерии были обнаружены в различных источниках воды, включая воду из колодцев, водопроводов, ручьев, рек, плавательных бассейнов [2].
В отличие от прежних представлений, в настоящее время считают, что практически любой представитель семейства энтеробактерий может быть, при определенных обстоятельствах, прича-стен к возникновению инфекционного процесса различной локализации. Из новых видов медицинское значение четко показано только для представителей Я. адиаНШ, которые характерны для широкого спектра поражений мочевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, гнойно-воспалительных раневых инфекций, абсцессов разной локализации, а также для больных диабетом, бронхиальной астмой, эмфиземой. По мнению исследователей представители В. адиайса не способны вызывать какой-либо инфекционной патологии, поскольку условия для их существования в организме человека просто отсутствуют, однако они могут вызывать кишечные инфекции у мелких млекопитающих, а также заболевания у растений. Вместе с тем, в 2007 г. [3] был описан случай развития сепсиса у 85-летней жительницы Нового Орлеана, пострадавшей в результате затопления ее дома во время урагана "Катрин". В ее крови и моче была идентифици-
рована В. aquatica, обнаруженная также и в водах, затопивших ее дом.
Поскольку важным фактором патогенности грамотрицательных бактерий является липопо-лисахарид (ЛПС), целью данной работы было выделить его из типового штамма В. aquatica, провести химическую идентификацию, а также изучить функциональную и биологическую активность ЛПС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследования был штамм В. aquatica DRL 20186 (DRL — Diagnostical and Research Laboratory, Budapest, Hungary), выделенный из воды колодца (Чехия, Пражский институт гигиены и эпидемиологии). Выращивание бактерий осуществляли методом периодического культивирования на круговых качалках с использованием синтетической среды N [4] в течение 24 ч при 28—30°C. Клетки собирали центрифугированием (20 мин, 5000 g), высушивали обработкой ацетоном и эфиром.
Выделение ЛПС. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток 45%-м водным раствором фенола при 65—68°С. Полученные водные фракции диализовали против водопроводной, а затем дистиллированной воды для удаления фенола [5].
Определение содержания углеводов, нуклеиновых кислот и белка. Количество углеводов определяли методом Дюбуа [6]. Оценку результатов осуществляли по изменению окраски при реакции фенола с серной кислотой на спектрофотометре при 490 нм. Содержание углеводов определяли в соответствии со стандартными калибровочными кривыми, которые предварительно строили по глюкозе.
Содержание нуклеиновых кислот оценивали по методу Спирина [7], белков — методом Лоури с использованием реактива Фолина [8].
Идентификацию нейтральных моносахаридов проводили после гидролиза препаратов в 2 M НС1 (5 ч, 100°С). Моносахариды анализировали в виде ацетатов полиолов [9] на хромато-масс-спектро-метрической системе Agilent 6890/5973N, колонка DB-225mS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), газ-носитель — гелий, поток через колонку — 1 мл/мин. Температура испарителя - 250°С, интерфейса — 280°С, термостата — 220°С (режим изотермический). Моносахариды идентифицировали, сравнивая время удерживания ацетатов полиолов исследуемых образцов со стандартами, а также используя компьютерную базу данных ChemStation. Количественные соотношения отдельных моносахаридов выражали в % от общей суммы площадей пиков или в % от сухого веса препарата.
Абсолютную конфигурацию моносахаридов определяли газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ) ацетилированных гликозидов с ^)-2-ок-
танолом. Анализ проводили на приборе Hewlett-Packard 5880, градиент температуры от 160°С (1 мин) до 290°С при 7°С/мин [10].
Определение жирнокислотного состава осуществляли после гидролиза образца в 1.5 % растворе хлористого ацетила в метаноле (100°С, 4 ч) и метиловые эфиры жирных кислот анализировали на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890N/5973 inert, колонка HP-5MS, длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина фазы 0.25 мкм, температурный режим 150—250°С, градиент температуры 4°С, газ-носитель — гелий, скорость потока через колонку 1.2 мл/мин. Температура испарителя 250°C, распределение потока 1 : 100. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью базы данных персонального компьютера, а также стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот.
ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР снимали для раствора ОПС в 99.95 D2O при 30°C на спектрометре Bruker Avance II 600 (Германия), используя 3-триметилсилипропионат-2,2,3,3^4 (SH 0 м.д.) и ацетон (SC 31.45 м.д.) в качестве внутренних стандартов. Перед съемкой спектров образцы лиофи-лизовали из 99.5% D2O.
Пирогенность ЛПС определяли на кроликах весом 2.0—3.5 кг [11]. Термометрию проводили с помощью электронного термометра ("Omron Matsusaka Co. Ltd", Япония), который вводили в прямую кишку на глубину 5—7 см (в зависимости от веса кролика). Предварительно всех кроликов испытывали на иммунореактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг 0.9%-ого стерильного непирогенного раствора хлорида натрия. Исследуемые препараты ЛПС растворяли в стерильном непирогенном изотоническом растворе, перед введением выдерживали в течение 10 мин при 37°C, после чего внутривенно вводили из расчета 1 мл/кг веса животных. Минимальную пирогенную дозу препаратов ЛПС определяли в серии разведений от 0.5 до 1.0 х 10-2 мг/мл. Каждую серию исследованных растворов проверяли на 3-х кроликах, близких по весу (разница не более чем 0.5 кг).
Перед введением раствора ЛПС у кроликов дважды измеряли температуру с интервалом 30 мин. Поскольку разница в показателях температуры не должна превышать 0.2°C, животных, которые не отвечали этому показателю, для исследований не использовали. Результат последнего измерения принимали за исходную температуру. Раствор ЛПС вводили не позднее чем через 15—20 мин после последнего измерения температуры. Последующие измерения проводили после введения препарата трижды с интервалом в 1 ч. Исследованный раствор ЛПС считали непироген-ным, если суммарная величина повышения температур за 3 ч была меньшей или равнялась 1.4°С.
Определение токсичности ЛПС проводили на здоровых белых беспородных мышах весом 19— 21 г обоих полов, ранее не использованных в каких-либо экспериментах, и сенсибилизированных галактозамином. Всем мышам вводили вн-трибрюшинно 0.5 мл 3.2%-ого раствора D-га-лактозамингидрохлорида в непирогенном стерильном растворе 0.9%-ного NaCl. После этого тотчас же вводили внутрибрюшинно 0.2 мл подогретого до 37°C ЛПС в изотоническом стерильном непирогенном физиологическом растворе со скоростью 0.1 мл/сек. В серии разведений ЛПС определяли дозу препарата, которая вызывала гибель 50% исследуемых животных (ЛД50), ее значение использовали для оценки токсичности ЛПС. Как в контрольной, так и в опытных группах использовали по десять мышей. Контрольной группе (10 мышей) вводили вместе с D-галактозамин-гидрохлоридом 0.2 мл стерильного раствора 0.9%-ного NaCl. Наблюдения за животными проводили в течение 48 ч [11].
Иммунологические исследования. О-Антисыво-ротку получали к прогретым (2.5 часа, кипящая водяная баня) клеткам В. aquatica. Кроликов иммунизировали внутривенно пятикратно, с интервалом 4 дня, концентрация клеток составляла 2 х 109/мл (от 0.1 до 1 мл) [11].
Антигенную активность ЛПС исследовали методом двойной иммунодиффузии в агаре по Оух-терлони [12].
Статис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.