МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 4, с. 416-425
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.234
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ рода лгозншььим, ОТНЕСЕННЫХ К СЕРОГРУППЕ II
© 2014 г. Е. Н. Сигида*, Ю. П. Федоненко*, Э. Л. Здоровенко**, Г. Л. Бурыгин*, С. А. Коннова***, В. В. Игнатов*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов **Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва ***Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Поступила в редакцию 10.10.2013 г.
Исследованы липополисахариды шести штаммов диазотрофных ризобактерий А10$рт11ит Ъгаяйете SR50, SR80, SR88, SR109, SR.H1, SR115) и А. Иро/егит SR42, выделенных из ризосферы злаковых растений в Саратовской области, которые на основе серологического анализа отнесены к серогруп-пе II азоспирилл. По составу жирных кислот липидов А исследуемые липополисахариды близки к таковым у других представителей Azospiгillum и характеризуются преобладанием 3-гидрокситетраде-кановой, 3-гидроксигексадекановой и октадеценовой кислот. С помощью моносахаридного анализа, включающего определение абсолютных конфигураций, анализа методом метилирования, одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР в составе О-специфических полисахаридов установлено наличие двух типов повторяющихся звеньев, представленных в разном соотношении. Показано, что высокая степень серологического родства между исследуемыми штаммами обусловлена наличием в составе их О-антигенов повторяющихся звеньев с идентичной структурой.
Ключевые слова: липополисахарид, структура О-специфических полисахаридов, серологические исследования, Azospiгillum.
DOI: 10.7868/S0026365614040156
Свободноживущие азотфиксирующие бактерии р. Azospirillum являются представителями а-протеобактерий. Они оказывают стимулирующее воздействие на рост и развитие растений, в том числе зерновых и кормовых злаковых культур [1]. Расширение знаний о структуре и свойствах основных компонентов поверхности азоспирилл имеет большое значение для понимания закономерностей формирования успешных ассоциаций с растениями и причин возникновения проблем при их биотехнологическом использовании. В реализации эффективных растительно-микробных взаимодействий задействован сложный механизм, связанный, в том числе, и с вариабельностью полисахаридов и белков клеточной поверхности [2].
Также как и другие грамотрицательные бактерии, Azospirillum продуцируют липополисахариды (Л ПС), формирующие внешний слой наружной мембраны, которые принимают участие во взаимодействии с различными макро- и микроорганизмами. Амфифильная молекула ЛПС представлена гидрофобным компонентом (липид А),
1 Автор для корреспонденции (e-mail: room308@ibppm.sgu.ru).
к которому через коровый олигосахарид (кор) присоединяется О-специфический полисахарид (О-антиген, О-цепь, ОПС), построенный из оли-госахаридных повторяющихся единиц или звеньев. Различают S-форму ЛПС, характеризующуюся наличием всех трех частей молекулы, либо R-форму, у которой углеводная часть ограничивается только кором. Следует отметить, что пока отсутствуют сведения о выявлении у азоспирилл дикого либо мутантного R-фенотипа ЛПС, утратившего О-цепь.
Антигенные детерминанты, локализованные в ОПС, могут быть использованы для построения серологических классификаций (серотипирова-ния) бактерий. Ранее к препаратам ЛПС ряда штаммов Azospirillum были получены кроличьи по-ликлональные антитела (Ат). Скрининговые серологические исследования О-антигенов Azospirillum позволили предложить классификационную схему, выделяющую три серогруппы для штаммов видов A. brasilense, A. lipoferum, A. irakense [3, 4]. Для азоспирилл серогрупп I и III была выявлена химическая основа серологического родства, определяемая наличием в основной цепи ОПС линейных олигосахаридных либо D-, либо L-рамнановых
Таблица 1. Бактериальные штаммы, используемые в работе
Штамм Характеристика
A. brasilense
SR50 SR80 SR88 SR109 SR111 SR115 Проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Саратовская 52 Проростки пшеницы (T. aestivum L.) сорта Саратовская 49 Проростки пшеницы (T. durum Desf.) сорта Харьковская 46 Проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта Зубовидная Проростки проса (Panicum miliaceum) сорта Саратовское 853 Проростки сорго (Sorghum bicolor (L.) Moench) сорта Саратовское сахарное
A. lipoferum
SR42 Корни пшеницы (T. aestivum L.) сорта Саррубра
фрагментов [5, 6]. Штаммы AzospirШum серогруп-пы II характеризовались наличием гетерополиса-харидных О-антигенов и демонстрировали серологический перекрест с антителами к ЛПС типового штамма A. brasilense 8р7. Однако детальный анализ результатов серологических исследований свидетельствовал о неоднородности О-антигенных детерминант представителей серогруппы II и необходимости дальнейшего типирования бактерий на основе химической структуры ОПС.
В этой статье мы представляем результаты структурных и серологических исследований О-антигенов шести штаммов A. brasilense и одного штамма А. lipoferum, серологически близких к А. brasilense 8Я80 — представителю серогруппы II азоспирилл, для которого недавно было установлено строение ОПС [7].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные в работе бактериальные штаммы (табл. 1), изолированные с корней различных злаков в Саратовской области, любезно предоставлены коллекцией бактериальных культур ИБФРМ РАН (г. Саратов). Культивирование бактерий проводили в жидкой малатно-солевой среде с витаминами [8] до окончания экспоненциальной фазы роста при температуре 30° С и перемешивании на вибростенде. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0.15 М растворе №С1 и смывали с поверхности капсуль-ный материал механическим перемешиванием в течение 5 сут со сменой отмывающего раствора каждые 12 ч.
ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бес-капсульных клеток горячим 45% водным раствором фенола без разделения слоев [9]. Примеси белков осаждали из раствора ЛПС добавлением 40% СС13С02Н до конечных значений рН 2.7.
Деградацию ЛПС проводили 2% СН3С02Н при 100°С в течение 4—5 ч. Образовавшиеся осадки липидов А отделяли центрифугированием. Во-
дорастворимые фракции разделяли гель-хроматографией на колонке с Sephadex G-50 в 0.05 М пиридин-ацетатном буфере (рН 4.5), контролируя элюцию с помощью дифференциального проточного рефрактометра Knauer (Германия).
Денатурирующий электрофорез препаратов ЛПС выполняли в 15% ПААГ [10]. Визуализацию компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе нитрата серебра [11]. В имму-нохимических методах использовали поликло-нальные кроличьи Ат (в концентрации 100 мкг/мл) к целым клеткам A. brasilense Sp245, обработанным глутаровым альдегидом, а также Ат к ЛПС A. brasilense Sp7, SR80 и Jm6B2. При иммуноблот-тинге [12] проводили электроперенос разделенных компонентов с ПААГ на нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0.2 мкм ("Sigma", США) в электрическом поле (при силе тока 200 мА) в течение 1.5 ч. Свободные сайты связывания на мембране блокировали 1% обезжиренным молоком в течение 1 ч. Иммунодетекцию проводили путем инкубации блотов с поликло-нальными кроличьими Ат. В качестве вторичных использовали козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma", США), и визуализировали взаимодействие с использованием субстрата 3,3'-диаминобензиди-на. Встречную радиальную иммунодиффузию препаратов ЛПС выполняли по стандартной методике [13] в 1% агарозном геле. Преципитат окрашивали красителем кумасси бриллиантовым голубым R-250. Твердофазный иммунофермент-ный анализ (ТИФА) выполняли в полистироль-ных 96-луночных планшетах ("Медполимер", Россия). По 50 мкл последовательных двукратных разведений образцов (в 0.15 М фосфатно-со-левом буфере, pH 7.2) вносили в лунки планшетов. Концентрация препаратов ЛПС в первой лунке составляла 50 мкг/мл. Для визуализации взаимодействия использовали козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma"). В качестве субстратного реаген-
Таблица 2. Химический состав ЛПС исследуемых штаммов азоспирилл
Компоненты Штамм
SR42 SR50 SR80 SR88 SR109 SR111 SR115
% от массы ЛПС Углеводы КДО Фосфор 34.1 ± 2.2 1.4 ± 0.1 0.50 ± 0.06 54.9 ± 3.7 0.5 ± 0.1 3.0 ± 0.3 29.3 ± 3.1 2.7 ± 0.1 0.10 ± 0.03 47.2 ± 5.4 1.1 ± 0.1 2.3 ± 0.1 47.8 ± 1.7 1.0 ± 0.1 3.4 ± 0.1 48.9 ± 3.1 0.7 ± 0.1 0.5 ± 0.1 40.4 ± 2.5 1.6 ± 0.1 0.17 ± 0.04
% от суммы площадей пиков МЭЖК 3-ОН-С14.0 С16:1 С16:0 3-ОН-С16.0 С18:1 С19:0 36.0 ± 4.6 3.4 ± 0.1 3.9 ± 0.1 14.4 ± 2.1 36.2 ± 3.9 5.5 ± 0.7 37.9 ± 4.9 2.7 ± 0.1 4.4 ± 2.5 18.3 ± 1.8 32.2 ± 5.6 4.4 ± 1.3 49.8 ± 1.2 Сл. 5.3 ± 0.4 23.9 ± 0.7 22.3 ± 0.4 1.7 ± 0.3 24.6 ± 2.2 5.6 ± 0.7 5.5 ± 0.8 10.6 ± 3.6 49.1 ± 7.3 Сл. 34.8 ± 2.0 3.6 ± 0.8 4.4 ± 0.7 15.6 ± 1.0 38.0 ± 4.5 Сл. 38.9 ± 4.1 1.8 ± 0.3 3.7 ± 0.5 20.0 ± 2.1 30.9 ± 3.3 4.8 ± 0.6 40.0 ± 3.4 2.8 ± 0.1 6.7 ± 0.9 15.1 ± 1.9 33.9 ± 1.0
Примечание. "Сл." — содержание компонента менее 1%; "—" — компонент не обнаружен.
та использовали перекись водорода с о-фенилен-диамином. Измерения оптического поглощения исследуемых проб проводили на иммунофер-ментном анализаторе Multiscan Ascent ("Thermo scientific", Финляндия) при X = 492 нм. При сравнении взаимодействия препаратов ЛПС с антителами использовались значения оптической плотности продуктов ферментативной реакции для максимальной концентрации ЛПС.
Колориметрическое определение содержания в препаратах ЛПС углеводов, КДО и фосфора проводили известными методами, описанными нами ранее [8]. Измерения выполняли на Specord 40 ("Analytik Jena AG", Германия).
Состав жирных кислот ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) определяли с помощью ГЖХ на хроматографе G^2010 ("Shi-madzu", Япония), снабженном колонкой DB-5 ("Agilent", США). Метилирование выполняли методом, описанным в работе [14]. Анализ моносаха-ридого состава и установление абсолютных конфигураций нейтральных сахаров проводили методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов [15] и ацетилиро-ванных гликозидов с оптически активным спиртом (Я)-2-октанолом [16] соответственно.
Спектры ЯМР записывали на спектрометрах DRX-500 и Avance II 600 ("Bruker", Германия) в раст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.