МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 656-666
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.11.22
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ PANTOEA AGGLOMERANS
© 2014 г. Л. Д. Варбанец*, S О. С. Броварская*, Т. Н. Булыгина*, Е. Г. Гаркавая**, Н. В. Житкевич*
*Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАНУкраины, Киев **Национальный авиационный университет, Киев Поступила в редакцию 01.04.2014 г.
Выделены липополисахариды (ЛПС) из семи штаммов Pantoea agglomerans, изолированных из различных растений, проведена их химическая идентификация. ЛПС исследуемых штаммов Р. agglomerans оказались довольно гетерогенными по моносахаридному составу. Так, ЛПС P. agglomerans 8606 в значительной степени отличался от ЛПС остальных исследуемых штаммов: доминирующим моносахаридом в его составе была манноза (69.8%), присутствовала также рибоза (15.1%) и ксилоза (12.6%), в то время как содержание рамнозы, одного из преобладающих моносахаридов остальных исследованных ЛПС, составляло всего 2.5%. Анализ жирнокислотного состава показал присутствие жирных кислот, содержащих в цепи от 12 до 16 атомов углерода. Преобладающей в липидах А ЛПС всех исследованных штаммов была 3-ОН-С140, от 31.7 до 39.1% в зависимости от штамма. Выявлены также С12:0 (от 8.2 до 31.5%), С14:0 (от 12.9 до 30.8%), С16:0 (от 3.4 до 16.9%) кислоты. По жирно-кислотному составу исследуемые штаммы P. agglomerans можно разделить на три группы. Различия обусловлены наличием либо отсутствием двух жирных кислот: 2-ОН-С14:0 и С16:1. Реакцией двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони показано, что все исследуемые ЛПС в гомологичных системах проявляли активность антигена. Результаты перекрестных серологических реакций свидетельствуют об иммунохимической гетерогенности вида P. agglomerans. Сравнительное изучение комплекса показателей клеток периферической крови здорового донора до и после обработки растворами ЛПС показало, что почти все показатели не выходят за границы нормальных значений.
Ключевые слова: РаЫова agglomerans, липополисахарид, моносахаридный состав, жирнокислотный состав, серологическая активность, биологическая активность.
DOI: 10.7868/S0026365614060202
Представители Pantoea agglomerans широко распространены в природе как комменсалы, эпифиты или эндофиты, существование которых ассоциировано со многими растениями, теплокровными и насекомыми. Они трансформировались в патоген, вызывающий различные типы поражения высших организмов: гнили, пятнистости, галлы (опухоли) на растениях, оппортунистические инфекции у человека и животных. Переход бактерии в хозяин-специфичный галло-образующий патоген произошел благодаря эволюции уникальной плазмиды патогенности Path [1]. Известно, что важную роль во взаимодействиях хозяин—патоген как у животных, так и у растений играют липополисахариды (ЛПС) [2, 3]. Специфические структурные особенности ЛПС могут иметь хемотаксономическое значение, в частности для представителей P. agglomerans, которых на протяжении многих лет относили к различным родам и видам бактерий: Enterobacter ag-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: varbanets@ serv.imv.kiev.ua).
glomerans, ЕтШа НегЫоо1а, ЕгмШа тШейае. В 1989 г. [4] в семействе ЕШетЬа^епасеае был описан новый род РаШоеа, в который включен вид Р. agglo-тегат, являющийся довольно гетерогенным по своим свойствам.
Поскольку в настоящее время в литературе очень мало данных относительно выделения и характеристики липополисахаридов фитопатоген-ных представителей Р. agglomerans, целью данной работы было изолировать ЛПС из штаммов Р. ag-glomerans, выделенных из различных растений, провести их химическую идентификацию, а также установить между ними серологические взаимосвязи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследований были 7 штаммов Р. аg-glomerans из коллекции отдела фитопатогенных бактерий ИМВ НАН Украины, изолированных из томатов — 7960 (Умань, Украина), яблони — 7969 (Минск, Беларусь), семян овса - 8456, 8488, 8490
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ PANTOEA AGGLOMERANS
657
(Румыния, присланы в коллекцию доктором T Laz-er), хлопка — 8606 (Санкт-Петербург, Россия, присланный в коллекцию К.Л. Хетагуровой), 8674 (LMQ 2565 = NCCPPB 2971, типовой штамм) (Бельгия, присланный доктором Лея).
Бактерии выращивали на картофельном агаре в течение 36 ч при 28—30°C. Клетки собирали центрифугированием (20 мин, 5000 g), высушивали обработкой ацетоном и эфиром.
Выделение ЛПС. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток 45%-м водным раствором фенола при 65—68°С. Полученные водные фракции диализовали против водопроводной, а затем дистиллированной воды для удаления фенола [5].
Определение содержания углеводов, нуклеиновых кислот и белка. Количество углеводов определяли методом Дюбца [5]. Оценку результатов осуществляли по изменению окраски при реакции фенола с серной кислотой на спектрофотометре при 490 нм. Содержание углеводов определяли в соответствии со стандартными калибровочными кривыми, предварительно построенными по глюкозе.
Содержание нуклеиновых кислот оценивали по методу Спирина [5], белков — по методу Лоури с использованием реактива Фолина [5].
Идентификацию нейтральных моносахаридов
проводили после гидролиза препаратов ЛПС в 2 M НС1 (5 ч, 100°С). Моносахариды анализировали в виде ацетатов полиолов [6] на хромато-масс-спек-трометрической системе Agilent 6890N/5973 inert, колонка DB-225mS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), газ-носитель — гелий, поток через колонку — 1 мл/мин. Температура испарителя — 250°С, интерфейса — 280°С, термостата — 220°С (режим изотермический). Пробу вводили с делением потока 1 : 100. Моносахариды идентифицировали, сравнивая время удерживания ацетатов полиолов исследуемых образцов со стандартами, а также используя компьютерную базу данных ChemStation. Количественные соотношения отдельных моносахаридов выражали в % от общей суммы площадей пиков.
Определение жирнокислотного состава осуществляли после гидролиза образца в 1.5% растворе хлористого ацетила в метаноле (100°С, 4 ч), и метиловые эфиры жирных кислот анализировали на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890N/5973 inert, колонка ^-5MS, длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина фазы 0.25 мкм, температурный режим 150—250°С, градиент температуры 4°С, газ-носитель — гелий, скорость потока через колонку 1.2 мл/мин. Температура испарителя 250°C, распределение потока 1 : 100. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью базы данных персонального компьютера, а также стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот. Количественные со-
отношения отдельных жирных кислот выражали в % от общей суммы площадей пиков.
Иммунологические исследования. О-антисыво-ротку получали к прогретым (2.5 ч, кипящая водяная баня) клеткам Р. а^Ьтвгат. Кроликов иммунизировали внутривенно пятикратно, с интервалом 4 сут, концентрация клеток составляла 2 х 109/мл (от 0.1 до 1 мл).
Антигенную активность ЛПС исследовали методом двойной иммунодиффузии в агаре по Оух-терлони [7].
В основе метода определения фагоцитарной активности нейтрофилов [8, 9] лежит способность фагоцитов захватывать частицы латекса, которые окрашиваются по Романовскому-Гимзе в голубовато-синий цвет. Расчет результатов проводили на 100 нейтрофилов при помощи микроскопа. Определяли фагоцитарный индекс (Фи) — количество клеток, способных к активному поглощению частиц, и фагоцитарное число (Фч) — число частиц латекса, которое поглощается одним фагоцитом. Оба эти показателя характеризуют поглотительную способность фагоцитующих клеток крови (нейтрофилов и моноцитов). В норме фагоцитарное число составляет 1.5—8.0 ед., фагоцитарный индекс — 40—80%.
Для проверки показателей врожденного иммунитета используется тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который отображает кислородзависи-мый метаболизм нейтрофилов [9]. Нами был использован НСТ-спонтанный тест, принцип которого состоит в том, что при соприкосновении с активированным нейтрофилом НСТ восстанавливается до диформазана, который в виде гранул, нерастворимых в воде и большинстве органических растворителей, откладывается в середине или на поверхности клеток. Количество диформазана служит критерием интенсивности реакции. Подсчет количества клеток, которые содержат гранулы диформазана, проводят под микроскопом. Процент НСТ-положительных клеток составляет процент от общего количества фагоцитирующих клеток крови. По количеству частиц диформазана в подсчитанных клетках определяют среднецитохимический коэффициент (СЦК) для оценки активности пе-роксидазных систем:
СЦК = 1 а 1 /4 + 2а 2/4 + 3 а3/4 + 4а 4/4 Ц 10о ,
где а1/4, а2/4, а3/4, а4/4 — количество клеток, в которых количество гранул формазана занимает 1/4, 2/4, 3/4, 4/4 площади клеток соответственно.
В норме среднецитохимический коэффициент составляет 0.06—0.7, а процент НСТ-положитель-ных клеток — 10—30%.
Влияние ЛПС на разные популяции лимфоцитов изучали по уровню экспрессии CDз- и
Таблица 1. Химическая характеристика ЛПС P. agglomerans
Показатели (% к сухой массе ЛПС) Штаммы
7960а 7969 8456 8488 8490 8606 8674 т
Выход ЛПС 5.9 9.5 14.0 10.9 5.2 8.4 6.8
Углеводы 32.0 29.0 24.0 38.0 42.0 35.0 42.0
Белок - Сл. - Сл. 0.8 -
Нуклеиновые кислоты 1.6 2.9 3.1 3.4 13.5 8.1 7.7
КДО 2.2 0.5 1.6 0.8 0.7 1.3 0.4
Примечание.
отсутствие; Сл. — следы.
Таблица 2. Моносахаридный состав ЛПС P. agglomerans
Моносахариды
ЛПС штаммов P. agglomerans
(% к общей сумме площадей пиков) 7960а 7969 8456 8490 8606 8488 8674
Rha 15.4 18.7 4.9 12.3 2.5 21.9 38.6
Fuc 14.8 14.9 - 14.5 - 25.9 -
Rib 1.7 1.1 22.3 29.8 15.1 2.8 6.2
Xyl - - - - 12.6 - -
Man 23.5 24.5 - 21.2 69.8 30.9 -
Gal 4.5 3.2 11.5 0.8 - 2.9 5.9
Glc 16.5 16.8 23.8 11.8 - 12.8 40.5
Hep 23.6 20.8 37.5 9.6 - 2.8 8.8
Примечание. " — " отсутствие.
CD^-рецепторов на Т- и В-лимфоцитах с помощью реакции розеткообразования с монокло-нальными антителами к вышеуказанным рецепторам [10]. В круглодонные лунки иммунологического планшета или микропробирки вносили 0.25 мл CD-диагностикума антител и добавляли равный объем лимфосмеси, инкубировали 25 мин при 37°C, центрифугировали при 500—1000 g, 3 мин и поме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.