МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 2, с. 164-171
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.86.017.7:577.152.1
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ Ре(Ш)-ЭДТА-
РЕДУКТАЗНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ТЕРМОФИЛЬНОЙ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ БАКТЕРИИ ТИЕЯМОТЕЯЯАБАСТЕЯШМ ЕЕЯЯШЕВиСЕт
© 2007 г. С. Н. Гаврилов*, А. И. Слободкин*1, Ф. Т. Робб**, С. де Врис***
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Центр морской биотехнологии, Балтимор, Мэриленд, США ***Факультет биотехнологии, Технологический университет, г. Делфт, Нидерланды
Поступила в редакцию 19.06.2006 г.
Суспензии целых клеток Thermoterrabacterium ferrireducens восстанавливали Fe(Ш) цитрат, Fe(Ш)-ЭДTA и ферригидрит с глицерином в качестве донора электронов. После разрушения клеток наибольшая же-лезовосстанавливающая активность отмечалась с Fe(Ш)-ЭДTA в качестве акцептора и НАД(Ф)Н в качестве доноров электронов. Около 80% НАД(Ф)Н-зависимых Fe(Ш)-ЭДTA-редуктазныx активностей содержалось в мембранной фракции клеток. Обработка мембран лаурилмальтозидом приводила к полной солюбилизации НАДН-зависимой и 70%-ной солюбилизации НАДФН-зависимой Fe(Ш)-ЭДTA-ре-дуктазных активностей. После очистки с помощью ионообменной хроматографии НАДН-зависимая активность была сконцентрирована в 8, а НАДФН-зависимая - в 11 раз, при выходе порядка 10% для обеих активностей. В состав ферментного комплекса, восстанавливающего Fe(Ш)-ЭДTA, входят цито-хромы c-типа и белок с молекулярной массой около 115 кДа, состоящий из двух полипептидов. Мембра-носвязанная Fe(Ш)-восстанавливающая оксидоредуктазная активность у грамположительной бактерии, диссимиляционно восстанавливающей Fe(ПI), описана впервые.
Ключевые слова: диссимиляционное восстановление Fe(III), термофильные микроорганизмы, грам-положительные бактерии, железоредуктаза, Thermoterrabacterium ferrireducens.
К диссимиляционному восстановлению Fe(III) способны бактерии и археи различных филогенетических и физиологических групп [1, 2]. Несмотря на последние достижения в понимании путей переноса электронов, задействованных в восстановлении Fe(III) у диссимиляционных железоредукторов [3, 4], ни для одного из исследованных к настоящему времени белков не доказана роль терминальной желе-зоредуктазы in vivo. Биохимия диссимиляционного восстановления Fe(III) интенсивно исследуется в основном у представителей двух родов - Shewanella и Geobacter, имеющих грамотрицательный тип клеточной стенки. Электрон-транспортная цепь у этих микроорганизмов состоит из многих компонентов, основными из которых являются цитохромы c-типа (см. обзор [1]). Большинство описанных цитохромов может восстанавливать Fe(III) in vitro, однако маловероятно, что в клетке все они выполняют функцию терминальных железоредуктаз. Мембраносвязан-ные НАДН-зависимые ферментные комплексы, способные восстанавливать Fe(III), охарактеризованы только для G. sulfurreducens [5, 6]. Следует отметить, что не все микроорганизмы, способные к дис-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: aslobodkin@hotmail.com).
симиляционной железоредукции обязательно содержат цитохромы.
Thermoterrabacterium ferrireducens - термофильная бактерия, диссимиляционно восстанавливающая Fe(III), филогенетически относящаяся к группе Firmicutes [7]. Этот микроорганизм способен к орга-нотрофному и литотрофному росту с нерастворимыми и растворимыми соединениями Fe(III) и урана (VI), имеет грамположительную клеточную стенку, окруженную S-слоем, и содержит цитохромы c-ти-па [8, 9]. Вследствие разного строения клеточной стенки грамотрицательных организмов и T. ferrireducens, механизмы восстановления Fe(III) у них предположительно отличаются. В настоящей работе приводятся данные о Fe(III)-восстанавливающиx активностях T. ferrireducens и частичной очистке и характеристиках мембраносвязанных Fe(III)^^TA-редуктазных активностей этого микроорганизма.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Организм, условия культивирования и оценка
роста. Штамм DSM 11255 Thermoterrabacterium ferrireducens был получен из Немецкой коллекции микроорганизмов (Deutsche Summlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen), Брауншвейг, Германия. Организм культивировали в анаэробной среде [7] с глицерином (30 мМ) в качестве источника углерода и донора электронов и фумара-том Na (20 мМ), цитратом Fe(III) (20 мМ) или ферригидритом (90 мМ Fe(III)) в качестве акцепторов электронов, либо без акцепторов. Ферригид-рит (слабо-кристаллический оксид Fe(III)) получали титрованием раствора FeCl3 ■ 6H2O 10%-ным раствором NaOH до pH 8.0. При культивировании с фумаратом или без акцептора среду предварительно восстанавливали добавлением Na2S ■ 9H2O до 0.5 г/л. Рост оценивали прямым подсчетом клеток с помощью световой фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Микмед-1, ЛОМО, Россия). В случае клеток, выращенных с ферригидритом, железосодержащий осадок растворяли смесью окса-лата аммония и щавелевой кислоты [8].
Определение ферментативных активностей.
Для экспериментов с суспензиями целых отмытых клеток последние собирали с 2 л среды в поздней экспоненциальной фазе на микрофильтре (размер пор 0.2 мкм) в атмосфере 100% N2. Клетки отмывали анаэробно 20 мМ МЭС-буфе-ром (pH 6.5) и ресуспендировали в свежей ростовой среде в отсутствие органических соединений, доноров и акцепторов электронов до конечной плотности порядка 1010 кл/мл. Аликвоты (0.10— 0.15 мл) свежих клеточных суспензий добавляли к 1 мл реакционной смеси, состоящей из анаэробной ростовой среды с донором электронов (30 мМ глицерином) и Fe(III)^TA (10 мМ), цитратом Fe(III) (20 мМ), либо ферригидритом (90 мМ Fe(III)). Реакционную смесь инкубировали 48 ч при 65°C и кинетику восстановления Fe(III) отслеживали с помощью определения концентрации Fe(II) с дипириди-лом [7] в отбираемых пробах. В качестве отрицательных контролей использовали реакционные смеси, в которых отсутствовали клетки, либо донор электронов. Активность с НАД(Ф)Н в качестве доноров электронов анализировали в присутствии феррозина по адаптированному методу [5]. Реакционная смесь содержала: 0.2 мМ НАДН или НАДФН в качестве донора электронов, 1 мМ феррозин и 0.5 мМ Fe(III)-ЭДтA, 0.5 мМ цитрат Fe(III), или 0.9 мМ Fe(III) в форме ферригидрита в качестве акцептора электронов в 100 мМ HEPES-буфере (рН 7.0), насыщенном N2. Реакцию начинали добавлением белкового образца (0.005-0.5 мг белка в объеме до 0.1 мл) в анаэробную (100% N2) кювету. Появление Fe(II) отслеживали непрерывно спектрофотометрически по A562 при 65°C. В качестве отрицательных контролей использовали реакционные смеси, не содержащие белковых образцов либо доноров электронов. Реакционная смесь для определения флавин-редуктазной активности содержала: 0.2 мМ НАДН или НАДФН в качестве донора электронов, 0.15 мМ ФАД или ФМН и 0.1 мМ MgCl2 в 50 мМ буфере mpuc-HCl
(pH 7.0), насыщенном N2. Реакцию начинали добавлением белкового образца, вели анаэробно, и окисление НАД(Ф)Н и восстановление флавинов непрерывно отслеживали при 65°C по уменьшению поглощения при 340 и 447 нм соответственно. В качестве отрицательных контролей использовали реакционные смеси без белковых образцов, с белковыми образцами без НАД(Ф)Н, а также с белковыми образцами и НАД(Ф)Н без флавинов. При всех оценках активностей использовали единицу mU, определяемую, как количество фермента, катализирующее образование 1 нмоль Fe(II) (или ФАД, или ФМН) за 1 мин при 65°C. Удельную активность (mU/мг) определяли как количество mU активности в препарате, отнесенное к общему содержанию белка в нем (в мг). Концентрацию белка определяли методом Лоури [10].
Спектрофотометрическое определение окси-доредуктазной активности. Этот метод был основан на быстром сканировании спектров поглощения образца в УФ-видимой области, позволяющем синхронно определять окислительно-восстановительное состояние цитохромов и количество окисленного НАД(Ф)Н после добавления Fe(III) в реакционную смесь. Анаэробная кювета (N2) содержала реакционную смесь, состоящую из 120 мкл белкового образца (в 20 мМ МЭС-буфере, pH 6.8), 0.15 мМ НАДН или НАДФН и 0.1 мМ Fe(III)-ЭДТА, 0.1 мМ цитрата Fe(III) или 0.09 мМ Fe(III) в форме ферригидрита в качестве акцептора электронов. Окислительно-восстановительное состояние цитохромов оценивали по характерным пикам поглощения при 420, 526 и 552 нм (восстановленная форма) и при 410 нм (окисленная форма). После добавления НАД(Ф)Н реакционную смесь инкубировали 4-6 мин, в течение которых цитохромы образца полностью восстанавливались. Затем добавляли Fe(III) и наблюдали за окислением цитохромов по изменению дифференциальных спектров (восстановленные цитохромы против окисленных). Одновременно отслеживали окисление НАД(Ф)Н по уменьшению поглощения при 340 нм. Все измерения активностей проводили на спектрофотометрах с УФ-видимым рабочим диапазоном (HP8453, "Hewlett Packard" США, и "Specord UV VIS", "Carl Zeiss" Германия), оборудованных термостатируе-мыми ячейками, при 65°C. Описанный спектрофо-тометрический метод использовали и для определения редуктазной активности в мембранной и растворимой клеточных фракциях T. ferrireducens по отношению к фумарату и АХДС (9,10-антрахинон-2,6-дисульфонату натрия). В реакционную смесь до конечной 0.5 мМ концентрации добавляли фу-марат или АХДС, вместо Fe(III), и о восстановлении этих соединений судили по окислению предварительно восстановленных цитохромов.
Очистка Ее(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей. Для очистки Fe(III)-ЭДТА-редуктазныx активностей использовали культуру, выращенную с
фумаратом в ферментере. Объем среды при этом составлял 200 л, объем инокулята - 10 л, культивирование вели в периодическом режиме, рост клеток контролировали по оптической плотности среды, анаэробность - путем автоматического определения концентрации растворенного кислорода. Клетки поздней экспоненциальной фазы роста собирали центрифугированием. Клеточную пасту, содержащую 150 г клеток (сырой биомассы), перед очисткой хранили замороженной при -80°C. Все последующие манипуляции с биомассой проводили аэробно при комнатной температуре. Клетки медленно размораживали и суспендировали в 20 мМ МЭС-буфере (pH 6.8) до концентрации 0.1 г сырой
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.