ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2009, № 3, с. 373-378
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 582.285.22:577.18
ХАРАКТЕРИСТИКА МИКОЦИНА Rhodotorula colostri (Castelli) Lodder
© 2009 г. В. И. Голубев, М. А. Томашевская
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАИ,
142290 Пущино E-mail: wig@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 17.07.2008 г.
Выделен штамм Rhodotorula colostri, обладающий фунгицидной активностью против родственных видов родов Rhodosporidium, Sporidiobolus и их анаморф, филогенетически принадлежащих порядку Sporidiobolales (Microbotryomycetes, Pucciniomycotina). Секретируемый агент с молекулярной массой около 4-5 кДа активен в кислом диапазоне рН среды до 5.5, термолабилен и чувствителен к действию протеаз.
Вид, описанный как Mycotorula colostri (Castelli, 1932), впоследствии был перенесен в род Rhodotorula Harrison (Lodder, 1934), а позднее его наименование отнесено к синонимам вида R. aurantiaca (Saito) Lodder (Lodder, Kreger-van Rij, 1952), что привело к значительной вариабельности описания последнего по диагностическим характеристикам. В частности, штаммы R. aurantiaca, включая типовой, ассимилируют глюкуронат (Голубев, 1989а) и устойчивы к микоцинам Rhodotorula mucilaginosa (Jörgensen) Harrison в противоположность R. colostri, культуры которого глюкуронат-отрицательны и чувствительны к указанным микоцинам. На этих основаниях вид R. colostri было предложено восстановить (Голубев, Чуркина, 1993). Позднее самостоятельность данного вида была подтверждена результатами се-квенирования домена D1/D2 гена 26S рРНК (Inacio, Fonseca, 2004).
Недавно обнаружен штамм R. colostri, подавляющий рост филогенетически родственных этому виду дрожжей. Характеристика секретируемого им антифунгального агента представлена в настоящей работе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследованы выделенные нами штаммы Ра-111 и Ра-125, все остальные использованные в работе культуры получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, http://www.vkm.ru).
Тестирование чувствительности выращенных на сусло-агаре (CA) трехсуточных культур осуществляли методом "культура против культуры" с инкубацией при комнатной температуре.
Для получения токсина изолят Ра-125 выращивали 4 сут на качалке (150 об/мин, 18°C) в разбавленном (2.5°Б) сусле (рН 5). Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин), и супернатант фильтровали через стеклобумагу GF/A (Whatman,
Великобритания). Эту активную культуральную жидкость использовали для оценки действия токсина на жизнеспособность дрожжей в процессе инкубации в ней, что количественно оценивали высевами на CA. Данная культуральная жидкость была использована также для проверки устойчивости токсина к повышенной температуре и протеолизу методом лунок в агаре. В целях ориентировочной оценки молекулярной массы токсина штамм Ра-125 неделю выращивали на разбавленном CA (рН 5), покрытом диализными мембранами (Spectrum, США), не пропускающими вещества определенной молекулярной массы. Затем мембрану вместе с культурой этого штамма удаляли и поверхность среды засевали газоном чувствительных дрожжей.
В целях элиминации антифунгальной активности 0.1 мл клеточной суспензии (104 кл/мл) штамма Ра-125 высевали на CA и инкубировали при 26°C. Выросшие колонии проверяли на наличие антифунгальной активности.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы Ра-111 и Ра-125, формирующие красные колонии, выделены в октябре 2007 г. при изучении сообществ дрожжевых грибов на хвойном опа-де Picea abies (L.) Karst. (Московская обл.). Они не образуют баллистоспор, телиоспор и по морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам соответствуют диагнозу рода Rhodotorula (The Yeasts ..., 1998). Данные изоляты нитрат-положительны, усваивают галактозу, сахарозу, мелецито-зу, маннит, не утилизируют инозит, глюкуронат, ри-бозу, рамнозу, лактозу, мелибиозу, рафинозу, эритрит и не растут при 30°C. Совокупность этих ключевых дифференцирующих признаков позволяет идентифицировать наши изоляты Ра-111 и Ра-125 как R. colostri. По ассимиляционному профилю первый из них идентичен типовому штамму BKM Y-330
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Время, ч
Гибель клеток 5. salmonicolor (штамм BKM Y-685) (исходная концентрация 2 х 103 кл/мл) при инкубации (20°С) в микоцин-содержащей культуральной жидкости Я. colostri Pa-125. По оси абсцисс: время, по оси ординат: относительное количество жизнеспособных клеток, %.
данного вида, а штамм Ра-125 отличается по двум характеристикам: неспособностью утилизировать а-метил^-глюкозид и рибит. Результаты микоци-нотипирования подтвердили видовую идентификацию этих изолятов. Как и типовой штамм R. colostri, они чувствительны к микоцинам, образуемым видами Rhodotorula dairenensis (Hasegawa et Banno) Fell et al. (Голубев, 19896) и R. mucilaginosa (Голубев, Чуркина, 1993).
В процессе скрининга выделенных с хвойного опада дрожжей у изолята R. colostri Ра-125 выявлена антибиотическая активность при использовании в качестве тест-культуры Rhodotorula glutinis (Fresenius) Harrison (штамм BKM Y-1115). Изолят Ра-111 таковой активностью не обладал и оказался чувствителен к фактору, секретируемому штаммом Ра-125.
Данный фактор активен лишь при кислых значениях рН среды, в диапазоне от 3.5 до 5.5. При рН 6 и выше активность не обнаруживалась. Некоторое влияние на уровень активности оказывали состав среды и буфера. Наибольшие зоны подавления роста чувствительных культур дрожжей наблюдались при рН 5 на разбавленном (2.5°Б) CA с цитрат-фосфатным буфером.
Образуемый штаммом Ра-125 фактор термолабилен: активность его заметно снижалась после 5 мин выдерживания при 100°C, после 10 мин была очень слабой и полностью исчезала через 15 мин прогревания. Фактор также инактивируется проте-азами: чувствителен к протеазе XIV, протеиназе К (Sigma, США), проназе Е и Р (Serva, Германия). Данный агент проникает через мембраны, задерживающие молекулы с массами 15 кДа и 6-8 кДа, но не проходит через мембрану, не пропускающую молекулы с массой около 3.5 кДа.
Судя по возникновению синей каймы на газоне чувствительных штаммов вокруг культуры Ра-125 на среде с метиленовым синим (0.03 г/л), он обладает фунгицидным действием, что подтверждается
падением численности жизнеспособных клеток дрожжей при инкубации их в культуральной жидкости штамма Ра-125 (рисунок).
В попытках элиминировать антифунгальную активность проведена инкубация рассева этого штамма при температуре, близкой к максимальной для его роста (27°C). Проверены более 50 случайно отобранных выросших колоний, и ни у одной из них не выявлено утраты данной активности.
Чувствительность к антифунгальному фактору, секретируемому R. colostri Pa-125, оказалась высокоспецифичной. Среди обследованных штаммов (221), принадлежащих к 136 видам 78 родов, к нему нечувствительны все аскомицетные, а также бази-диомицетные дрожжи, филогенетически относящиеся к классам Agaricomycetes, Agaricostilbo-mycetes, Cystobasidiomycetes, Exobasidiomycetes, Puc-ciniomycetes, Tremellomycetes и Ustilaginomycetes (табл. 1). Спектр чувствительных организмов ограничен лишь несколькими видами телеоморфных родов Rhodosporidium Banno, Sporidiobolus Nyland и анаморфных родов Rhodotorula и Sporobolomyces Kluyver et van Niel (табл. 2). За исключением R. glutinis (Fresenius) Harrison, штаммы одного вида имели однотипную реакцию к исследованному микоцину.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Чувствительность к протеазам свидетельствует о белковой природе фунгицидного фактора, образуемого R. colostri Pa-125. Он также термочувствителен, однако следует отметить, что его инактивация наступает лишь после 10 мин выдерживания при 100°C, что обусловлено, очевидно, невысокой молекулярной массой фактора (в пределах 4-5 кДа). Указанная химическая природа антифунгального агента, проявление им активности при кислых значениях рН среды, а главное - специфичность действия, направленного лишь против филогенетически родственных организмов, позволяют отнести его к микоцинам (Golubev, 2006). Синтез его детерминирован, вероятно, хромосомными генами, поскольку инкубация при повышенной температуре, эффективно элиминирующая внехромосомные генетические элементы, не приводила к появлению клонов, утративших микоциногенную активность.
Спектр действия микоцина R. colostri (табл. 2) весьма узок, особенно если учесть, что Rhodotorula graminis di Menna и Sporobolomyces holsaticus (Fischer et Brebeck) Kluyver et van Niel рассматриваются как анаморфы Rhodosporidium paludigenum Fell et Talman и Sporidiobolus johnsonii Nyland (The Yeasts ..., 1998), а последнее наименование некоторые авторы относят к синонимам Sporidiobolus salmonicolor Fell et Tallman (Valerio et al., 2008).
Гетерогенность R. glutinis в отношении чувствительности к микоцину R. colostri была ожидаема, поскольку данный вид и таксономически гетероге-
Таблица 1. Роды дрожжевых грибов, нечувствительные к микоцину R. colostri Ра-125
Agaricostilbum Kazachstania Saturnispora
Ambrosiozyma Kluyveromyces Schizosaccharomyces
Arthroascus Kockovaella Sebacina
Atractogloea Kondoa Sphacelotheca
Bensingtonia Kurtzmanomyces Stephanoascus
Bulleromyces Lachancea Sterigmatomyces
Citeromyces Leucosporidium Sympodiomycopsis
Clavispora Lipomyces Tetrapisispora
Cryptococcus Lodderomyces Tilletiopsis
Curvibasidium Mastigobasidium Torulaspora
Cystofilobasidium Metchnikowia Trichosporon
Debaryomyces Microstroma Trimorphomyces
Dekkera Mrakia Tsuchiyaea
Dioszegia Nadsonia Udeniomyces
Endophyllum Nakaseomyces Vanderwaltozyma
Erythrobasidium Naumovia Wickerhamia
Farysia Nematospora Wickerhamiella
Farysizyma Pachysolen Williopsis
Fellomyces Pichia Wingea
Guilliermondella Pseudozyma Xanthophyllomyces
Gymnosporangium Saccharomyces Yarrowia
Hanseniaspora Saccharomycodes Zygoascus
Hormoascus Saccharomycopsis Zygosaccharomyces
Issatchenkia Sakaguchia Zygotorulaspora
Itersonilia Zygowilliops
нен, и представляет собой комплекс анаморф нескольких видов Rhodosporidium (The Yeasts ..., 1998), также различающихся по чувствительности к этому микоцину (табл. 2).
К настоящему времени уже имеются публикации о киллерной (микоциноген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.