МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 2, с. 170-179
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ШТАММА НЕСЕРНОЙ ПУРПУРНОЙ БАКТЕРИИ ИЗ ТЕРМАЛЬНОГО ИСТОЧНИКА
© 2014 г. Е. Н. Нуянзина-Болдарева*, А. М. Калашников*, В. А. Гайсин**, М. В. Сухачева**, Б. Б. Кузнецов**, В. М. Горленко*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 13.06.2013 г.
Из мата низкотемпературного термального источника Кучигер (Байкальская рифтовая зона, Бурятия, Россия) выделен новый штамм Ku-2 почкующейся несерной пурпурной бактерии (НПБ) рода Rhodobacter. Бактерии имеют ламеллярный тип фотосинтетических мембран, что характерно только для одного вида рода Rhodobacter, Rba. blasticus. Исследованные микроорганизмы содержат кароти-ноиды сфероиденового ряда и бактериохлорофилл а (Бхл а). Спектр поглощения клеток in vivo имеет основной максимум поглощения при длине волны 863 нм и дополнительный при 887 нм, что характерно для пигмент-белковых комплексов мембран, содержащих Бхл а. У описанных ранее штаммов Rba. blasticus в спектрах поглощения клеток максимум при 887 нм не выявляется. Новый изолят является фотогетеротрофом, его оптимальный рост происходит при температуре 35°С, концентрации NaCl 3 г/л и рН 7—8. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 64.4 мол. %. Уровень сходства штамма Ku-2 с типовым штаммом вида Rba. blasticus по данным сравнительного анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, составляет 98.7%. Сходство аминокислотных последовательностей PufM штамма Ku-2 и исследованного ранее штамма Rba. blasticus составляет 89.0%. Таким образом, бактерии штамма Ku-2 относятся к роду Rhodobacter и филогенетически близки к виду Rhodobacter blasticus.
Ключевые слова: аноксигенные фототрофы, протеобактерии, семейство Rhodobacteriaceae, Rhodobacter blasticus.
DOI: 10.7868/S0026365614020025
В группу несерных пурпурных бактерий (НПБ) входят фенотипически и филогенетически разнообразные виды. Большинство видов НПБ растут анаэробно на свету фотогетеротрофно за счет использования различных источников органического углерода. Лишь некоторые виды НПБ способны к хемогетеротрофному росту в темноте в микроаэробных или аэробных условиях.
НПБ принадлежат к а- и Р-протеобактериям. Rhodobacter blasticus относится к а-протеобакте-риям и отличается от других видов рода Rhodobacter способом размножения — почкованием, а также кольцевой ламеллярной структурой фото-синтезирующих мембран [1]. Rba. blasticus при анаэробном росте, благодаря наличию в клетках каротиноида сфероидена, имеет оранжево-коричневый цвет. В присутствии кислорода сфероиден превращается в сфероиденон, придающий клеткам пурпурный цвет. Спектр поглощения культуры клеток типового штамма Rba. blasticus in vivo имеет максимумы при 378, 418, 476, 506,
1 Автор для корреспонденции (e-mail: boldareva@gmail.com).
590, 795, 862 нм [1]. Описанный нами ранее штамм ЯЬа. blasticus ЯЪ5 имеет сходные с типовым штаммом максимумы спектров поглощения клеток [2]. Этот штамм, использованный в работе, филогенетически близок к типовому штамму ЯЬа. Ьlasticus АТСС 33485т. Уровень сходства последовательностей генов 168 рРНК ЯЪ5 и ЯЬа. Ьlasticus АТСС 33485 составляет 99.7%.
Из термального источника Кучигер (Бурятия, Россия) нами выделен новый штамм Ки-2 почкующейся несерной пурпурной бактерии близкий по фенотипическим и филогенетическим характеристикам виду КНоёоЬа&ег Ьlasticus. Клетки бактерий штамма Ки-2, выращенные в фототрофных условиях, имеют основной максимум поглощения бактериохлорофилла а при 863 нм, а также небольшой максимум (или плечо) при 887 нм. Подобные спектры поглощения характерны для некоторых других видов рода RhodoЬacter, но не для известных штаммов RhodoЬacter Ьlasticus [1].
Целью исследования стало изучение нового изолята, имеющего необычные спектральные характеристики.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные штаммы и методы культивирования. Кроме вновь изолированного штамма НПБ Ku-2, для сравнительных исследований использовали штамм НПБ Rb5, выделенный из микробного мата гидротермы "Большая река" (Прибайкалье) [2].
Для культивирования НПБ использовали среду следующего состава (г/л): NH4Cl — 0.4; KH2PO4 — 0.5; MgCl2 - 0.2; Na2SO4 - 0.5; дрожжевой экстракт — 1; ацетат Na — 1; пируват Na — 1; NaCl — 1; Na2S2O3 • 5H2O — 1; KCl — 0.5; NaHCO3 — 1; витамин В12 — 10 мкг/л; раствор микроэлементов по Пфеннигу — 1 мл/л [3]. Растворы NaHCO3 (10%), дрожжевого экстракта (5%), ацетата Na (10%), пирувата Na (10%) и тиосульфата Na (10%) готовили и стерилизовали отдельно, а затем вносили в основную среду непосредственно перед посевом. В готовой среде рН доводили до 7.5—8.0. Бактерии культивировали анаэробно на свету в пени-циллиновых флаконах полностью заполненных жидкой средой и закрытых резиновыми пробками объемом 20 мл, а также аэробно в темноте в конических колбах объемом 500 мл. Очистку культур проводили на чашках Петри путем последовательных пересевов отдельно аэробно выросших колоний на поверхности плотной среды, содержащей 2% (w/v) агара. Чистоту выделенных культур контролировали микрокопированием.
Морфология, тонкое строение. Морфологические характеристики бактериальных клеток определяли в световом микроскопе Olimpus BX40 (Япония) с фазовым контрастом. Дополнительные морфологические и цитологические характеристики определяли с помощью электронного микроскопа JEM-100C ("Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ на тотальных препаратах клеток, контрастированных 0.2% водным раствором уранилацетата и на ультратонких срезах. Для получения ультратонких срезов сконцентрированные центрифугированием клетки обрабатывали по методу Келленберга и после обезвоживания заключали в эпон. Срезы, изготовленные на ультрамикротоме, помещали на медные сеточки, покрытые формваровой пленкой. Для контрастирования клеток использовали реактив Рейнольдса [4].
Метод анализа жирных кислот. Пробу сухой биомассы клеток (5 мг) обрабатывали 0.4 мл 1 н хлористого водорода в метаноле при 80° С в течение одного часа (кислотный метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры экстрагировали гексаном и вводили в газовый хрома-
тограф (Microbial identification system, "MIDI Inc.") [5].
Пигментный состав. Состав пигментов определяли по спектрам поглощения на спектрофотометре СФ-56А ("ЛОМО", Россия) в диапазоне длин волн 350—1020 нм. Для этого готовили суспензию целых клеток в 50% водном растворе глицерина или использовали фракцию клеточных мембран, полученную после разрушения клеток ультразвуком и удаления грубых фрагментов клеток центрифугированием. Кроме того, исследовали спектральные характеристики ацетон-мета-нольных (7 : 2) экстрактов клеток.
Физиологические свойства и условия роста. Для определения потребляемых органических субстратов использовали приведенную выше среду с витамином В12 (10 мкг/л) и дрожжевым экстрактом (0.1 г/л), в качестве витаминной добавки, и не содержащую других органических соединений. Испытуемые органические вещества вносили в концентрации 1 г/л. Конечное значение рН доводили до 8.0.
Толерантность бактерий к сульфиду натрия и способность к его использованию определяли, выращивая микроорганизмы анаэробно на свету при разных концентрациях Na2S • 9H2O: 0, 300, 500, 700 и 1000 мг/л. Выращивание бактерий при различных концентрациях NaCl и значениях рН проводили в анаэробных условиях на свету. Для определения способности бактерий к росту при разных значениях рН использовали фосфатный буфер в диапазоне рН 6.8-7.4. Для приготовления сред с щелочными значениями рН (8.0-9.5) применяли карбонатные буферные растворы. Для определения оптимальной температуры для роста изолята его культивировали в градиентном термостате в диапазоне температур от 10 до 50°C. Урожай клеток оценивали по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 650 нм на фотометре КФК-3. Чувствительность к антибиотикам выявляли по размеру стерильного зоны вокруг дисков, содержащих исследуемый антибиотик, при аэробном росте клеток на чашках Петри.
Молекулярно-генетические исследования. Выделение ДНК из клеток выполняли по описанному ранее методу щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии фирмы "Promega" [6]. Измерение содержания ДНК в полученном растворе и оценку его чистоты проводили на спектрофотометре Smart Spec 3000 ("BioRad", США).
Амплификацию гена 16S рРНК и секвениро-вание полученных ПЦР-фрагментов проводили с универсальными бактериальными праймерами 27f и 1492r [7]. Амплификацию участка оперона pufLM и секвенирование полученных ПЦР-фраг-ментов осуществляли с помощью специфичной
для пурпурных бактерий праймерной системы, описанной ранее [8, 9]. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл — 94°C х 2 мин, 56°C х 30 с, 72°C х 1 мин 30 с; последующие 42 цикла - 94°C х 30 с, 56°C х 30 с, 72°C х 1 мин 30 с; окончательная полимеризация — 72°C х 5 мин. Во всех вариантах ПЦР объем ам-плификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы Bio-Taq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Россия).
Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1.0% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием при напряжении поля 6 В/см. Фиксирование результатов электрофореза проводили с помощью системы гель-документации Bio Doc Analyzer ("Biometra", Германия).
Для секвенирования продуктов амплификации использовали метод Сэнгера с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730 ("Applied Biosystems", США) согласно инструкции производителя. Полученные последовательности редактировали с помощью программы BioEdit [10]. Для первичного сравнительного анализа полученных de novo последовательностей с последовательностями базы данных GenBank использовали программы BLAST [http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/blast]. Филогенетический анализ и постр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.