ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 442, № 4, с. 551-554
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.218+577.151.45+577.112.083
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ М42 АМИНОПЕПТИДАЗЫ ИЗ КРЕНАРХЕИ DESULFUROCOCCUS KAMCHATKENSIS
© 2012 г. Э. С. Слуцкая, Е. Ю. Безсуднова, А. В. Марданов, В. М. Гумеров, Т. В. Ракитина, В. О. Попов, член-корреспондент РАН В. М. Липкин
Поступило 12.10.2011 г.
Гипертермофильные микроорганизмы, образующие закрытые, устойчивые к различным физико-химическим факторам среды, сообщества глубоководных термальных источников, являются уникальным объектом изучения механизмов адаптации и стрессоустойчивости. Расшифровка и аннотация их геномов открывает доступ к изучению экстремозимов и пониманию механизмов адаптации на молекулярном уровне.
Данная работа посвящена получению и характеристике новой (гипотетической) аминопепти-дазы из анаэробной кренархаеоты D. kamchatken-sis, геном которой был недавно расшифрован и аннотирован [1, 2]. Выравнивание аминокислотной последовательности белка в программе BLAST [3] показало, что ближайшими гомологами белка являются гипотетические целлюлазы из D. mucosus и T. aggregans (87 и 76% гомологии соответственно) и металлозависимые аминопепти-дазы семейства М42 [4] из S. marinus и T. uzonien-sis (55 и 53% гомологии соответственно), причем гомология с наиболее изученными ферментами этого класса — мультисубъединичными амино-пептидазами из P. horikoshii PhTETl, PhTET2 и PhTET3 [5, 6] составила 48%.
Для клонирования гена Dkam_0589 и создания штамма продуцента рекомбинантной APDkam589, содержащей на N-конце последовательность из шести остатков гистидина, применяли классический подход: ПЦР на матрице геномной ДНК из D. kamchatkensis с использованием олигонуклео-тидов: 5'-GAGGGATCCGGTGAACACCTTG-GAATGGAGGG-3' — прямой праймер, 5'-GTAG-
Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии наук, Москва Центр "Биоинженерия" Российской Академии наук, Москва Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва
GATCCACAACAGGCTCCTCATAGCTT- 3' - обратный праймер, синтезированных на основании нуклеотидной последовательности гена, фланкированной сайтами эндонуклеазы рестриктазы Bam HI; обработка продукта ПЦР и вектора pET-15b рестриктазой Bam HI с последующим выделением фрагментов из агарозного геля, лигированием и трансформацией клеток E. coli штамм DH10B. После проверки точности клонирования с помощью автоматического секвенирования полученной плазмидной конструкцией pET_APDkam589 трансформировали штамм Rosetta-gami DE3. Для наработки рекомбинантного белка штамм-продуцент культивировали в среде LB ("RPI", США), содержащей ампициллин 100 мкг/мл и хлорамфе-никол 20 мкг/мл при 37°C. Экспрессию индуцировали IPTG (1 мМ) с последующей инкубацией при 37°C в течение 3 ч. Для выделения APDkam589 клетки Е. coli разрушали на Френч-прессе с последующим прогреванием гомогената (70°С, 10 мин) и очисткой целевого белка с помощью металлохелатной хроматографии (№2+-сефароза FF) и гель-фильтрации (Superdex™ 200 10/300). Молекулярная масса мономера рекомбинантной APDkam589, определенная методом ДСН-ПААГ, составила 43.2 кДа и соответствовала расчетной. Выход белка составлял 5-6 мг с 1 л культуры при чистоте 95%.
С учетом результатов выравнивания субстратная специфичность APDkam589 была проанализирована как с целлюлозными, так и с пептидными субстратами (табл. 1). Как видно из табл. 1, APDkam589 не проявляет эндоглюканазной, N-де-блокирующей и эндопротеолитической активностей. Анализ ферментативного гидролиза низкомолекулярных пептидов показал, что APDkam589 катализирует реакцию отщепления N-концевого неполярного аминокислотного остатка. Последующее расщепление дипептида не наблюдалось (рис. 1). Эксперименты по ингибированию ферментативного гидролиза L-Leu-pNA показали, что только бестатин и ЭДТА являются эффективными ингибиторами активности APDkam589 (остаточная активность 30 и 0% соответственно),
552 СЛУЦКАЯ и др.
Таблица 1. Гидролитическая активность APDkam589
Результат,
Активность Субстрат Метод детекции Условия реакции наличие активности**
Эндоглюканазная pNP-ß-D-целлобиозид Авицел СФ Карбоксиметилцеллюлоза [7], [8] 0.1 М Tris-HCl pH 5.3-8.0, 0.2 М NaCl, 50°C; 0.5 мл 0.1-0.5% субстрата, 10-20 мкг/мл фермента -
Экзопротеолитическая
Пептидазная AFF LLF ТСХ, см. в подписи к рис. 1 50 мМ MOPS pH 7.5*, 0.1 M NaCl (РБ), 50°C*, 1 мМ субстрата, 0.5-1 мкг/мл фермента + +
Arg-pNa Z-Leu-pNa* СФ, 405 нм, б405 = = 10600 M-1 ■ cм-1 РБ, 50°C, 4 мМ субстрата, 1-6 мкг/мл фермента 4.1 ед/мг***
N-деблокирующая N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa -
Эндопротеолитическая Желатин Зимография в ПААГ [9], 5—20 мкг фермента -
* Оптимальные рН и температура РБ были выбраны на основании анализа зависимости активности ЛРВкаш589 в реакции
с Х-Ьеи-рКа от рН в диапазоне 6—9 и температуры в диапазоне 40—80°С. ** В графе "наличие активности" — плюс — есть активность, минус — нет активности. *** Удельная активность ЛРВкаш589, 1 ед. активности соответствует количеству фермента, гидролизующему 1 мкмоль Х-Ьеи-рКа за 1 мин.
леупептин, апротинин и пепстатин практически не оказывали влияния на активность фермента (остаточная активность 82, 85 и 100% соответственно). Полученные результаты подтверждают, что исследуемый фермент является аминопепти-дазой, активный центр которой не содержит се-рин и цистеин.
Известно, что аминопептидазы семейства М42 являются Zn- или Со-зависимыми металлопроте-азами [4]. Ингибирование активности ЛРЭкаш589 введением в реакционный буфер (РБ) 2 мМ ЭДТА (табл. 1) указывает на участие катионов металлов в катализе и/или в структурной организации активного центра. Влияние металлов на активность ЛРЭкаш589 анализировали в РБ при 50°С, используя апо-форму фермента, полученную в результате диализа фермента в течение 10 ч против РБ с добавлением 2 мМ ЭДТА и 2 мМ о-фенан-тролина. Как следует из табл. 2, наибольшая активность апо-фермента наблюдалась в присутствии М§2+, Мп2+ и Zn2+.
Дальнейшие биохимические эксперименты проводили с Х-Ьеи-р№ в РБ с 2 мМ Мп2+ при 50°С.
Известно, что рекомбинантные ферменты из термофильных организмов имеют тенденцию к активации под воздействием температуры. Прогревание ЛРЭкаш589 (600 мкг/мл) в течение 1 ч при 70° С привело к повышению удельной актив-
ности до 20—22 ед/мг. Дальнейшее прогревание препарата не приводило к увеличению активности. Достигнутая активность сохранялась в течение 12 ч после охлаждения до комнатной температуры. По-видимому, при нагревании белок переходит в более активную конформацию. Сравнение
0
Ala Phe
_i_i_i_i_i_i_i_i_i_
0 2 4 8 15 30 60 Время реакции, мин
Рис. 1. Накопление аланина в процессе ферментативного гидролиза трипептида AFF (ATG Service Gene) в присутствии APDkam589. Продукты реакции окрашивались нингидрином (0.2%-го раствора в этаноле). По краям были нанесены стандарты (A и F). ТСХ, пластины Silica Gel 60 (EMD Chemicals, Inc.), мобильная фаза — бутанол/уксусная кислота/вода 12/3/5 (об/об/об)).
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ М42 АМИНОПЕПТИДАЗЫ
553
Таблица 2. Эффект влияния двухвалентных ионов металлов на активность апо-формы АРБкаш589
Ионы металлов, 1 мМ Относительная активность*, %
Zn2+ 136.7
Co2+ 50.0
Ca2+ 36.7
Cu2+ 22.0
Mg2+ 195.0
Mn2+ 206.7
Fe2+ Осадок
Оптическое поглощение,
отн. ед. 200
150
100
50
0
Декамер
9 • 10 3 град • см2 • дмоль 1 1
Октамер
0 -1 -2 -3
200 210 220 230 240 250 260 Длина волны, нм
Димер
0 10 20 30 Объем элюента, мл
Таблица 3. Кинетические параметры реакции ферментативного гидролиза £-Ьеи-р№ препаратами АРБкаш589 (1-6 мкг/мл) и ИАРБкаш589 (1-6 мкг/мл)
Образец V, v max 5 мкмоль • -1 • мин 1 • —1 • мг 1 КМ, мМ kKâT, с 1 ^а^^М, М-1 • см-1
APDkam589 HAPDkam589 7.5 ± 0.3 26.5 ± 0.5 1.8 ± 0.15 1.2 ± 0.05 5.4 ± 0.5 19.0 ± 0.7 3.0 • 103 15.8 • 103
* За 100% активности фермента принималась активность реком-бинантной APDkam589 в реакции с Z-Leu-pNa в РБ при 50°C.
кинетических параметров ферментативного гидролиза Х-Ьеи-рКа АРБкаш589 и прогретым препаратом белка (ИАРБкаш589) также указывает на конформационные изменения в ферменте при прогревании (табл. 3). Как следует из таблицы, константы Михаэлиса для обоих белков практически не различаются, однако константы скорости первого и второго порядков у ИАРВкаш589 были выше в 4 и 5 раз соответственно. Полученные данные позволяют предположить, что структурные изменения, которые произошли вследствие тепловой активации белка, затрагивают в первую очередь активный центр, но не влияют на связывание субстрата.
Все охарактеризованные на сегодня М42-ами-нопептидазы имеют мультимерную структуру от додекамеров: TET из H. marismortui [10], PhTET2 и PhTET3 из P. horikoshii до 24-мерных гомооли-гомеров: PhTETl из P. horikoshii [5, 6]. Методом гель-фильтрации установлено, что APDkam589 на 70% состоит из смеси октамер/димер в соотношении 2 : 1. Для HAPDkam589 наблюдаются преимущественно декамеры (рис. 2).
Для исследования структурных изменений фермента при нагревании был проведен анализ спектров КД (Chirascan circular dichroism spectrometer, Applied Photophysics) APDkam589 и HAPDkam589 в дальнем УФ диапазоне (200— 260 нм). Спектры обоих белков при 20°C были практически идентичны (рис. 2, врезка), что указывает на то, что активация фермента нагреванием, по-видимому, не приводит к существенным изменениям вторичной структуры отдельных мономеров.
В представленной работе описаны экспрессия в E. coli, выделение и характеристика нового реком-бинантного фермента из термостабильной кренар-хеи D. ramchatkensis. Получено экспериментальное подтверждение, что APDkam589 является метал-лозависимой аминопептидазой с наибольшим сродством к ионам марганца и магния. Изучение роли температурного фактора в активации фермента показало, что термоактивация APDkam589 является следствием изменения олигомерного состава и, возможно, конформационных изменений, затрагивающих ориентацию каталитических групп активного центра фермента.
Работа проводилась при финансовой поддержке М
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.