ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 236-240
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.252
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ ПЛАЗМИДЫ pMTB1 ИЗ МЕТАГЕНОМА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОДЗЕМНЫХ ТЕРМАЛЬНЫХ ВОД
ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
© 2014 г. В. В. Кадников*, А. В. Марданов*, А. В. Белецкий*, О. В. Карначук**, Н. В. Равин*
*Центр "Биоинженерия" РАН, 117312Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1 **Национальный исследовательский Томский государственный университет, 634050 Томск, просп. Ленина, 36
E-mail: nravin@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 21.10.2013 г.
В результате секвенирования метагенома идентифицирована новая кольцевая плазмида pMTBl длиной 4935 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность pMTBl имеет высокое сходство с нук-леотидными последовательностями плазмид pME2001 и pME2200 из метаногенной археи Methano-thermobactermarburgensis. Установлено, что одним из шести предсказанных генов pMTBl кодируется белок, содержащий ДНК-связывающий helix—turn—helix и АТФ/ГТФ-связывающий мотивы и, вероятно, участвующий в инициации репликации плазмиды. Гомологи остальных генов найдены только в плазмидах M. marburgensis, но их функции неизвестны. Сравнение плазмид pMTBl, pME2001 и pME2200 показало, что они имеют общее происхождение, но различаются наличием нескольких фланкированных прямыми повторами вставок в районах, не вовлеченных в контроль репликации.
DOI: 10.7868/S0002332914030072
Несмотря на то что в последние 20 лет у архей были описаны десятки плазмид (Lipps, 2007), исследования архейных плазмид все еще находятся на начальной стадии и для большинства из них неизвестен даже механизм репликации. Плазмиды были обнаружены в различных археях. При анализе 120 штаммов архей порядка Sulfolobales было обнаружено несколько плазмид и вирусов (Zillig et al., 1994), причем некоторые из них, в частности плазмида pRN1 и вирус SIRV1, стали модельными объектами генетики архей. Плазмиды были выявлены и у эуриархей: ~40% проанализированных штаммов архей порядка Thermo-coccales содержали плазмиды (Prieur et al., 2004; Soler et al., 2011). Плазмиды встречаются также у галофильных архей и метаногенов.
Известны как плазмиды архей, реплицирующиеся по механизму катящегося кольца, так и плазмиды, репликация которых осуществляется по тета-механизму. Некоторые из белков, участвующих в инициации репликации плазмид по механизму катящегося кольца (например, белок Rep75 плазмиды pGT5 из гипертермофильной археи Pyrococcus abyssi), были охарактеризованы биохимически (Marsin, Forterre, 1998). Однако механизмы репликации плазмид метаногенных архей еще не изучены, хотя для некоторых из них определены полные нуклеотидные последовательности, в том числе для двух близкородствен-
ных плазмид pFV1 (13.5 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.)) и pFZ1 (11 т.п.н.) из Methanothermobacter marburgensis (ранее известен как M. thermoau-totrophicum) (Nolling et al., 1992), двух внехромо-сомных элементов (16.6 и 58.4 т.п.н.) из Methano-coccus jannaschii (Bult et al., 1996), плазмид pURB500 (8.3 т.п.н.) из Methanococcus maripaludis C5 (Tumbula et al., 1997) и pC2A (5.5 т.п.н.) из Methanosarcina acetivorans C2A (Metcalf et al., 1997). Метаногенные археи M. marburgensis штаммов Marburg DSM 2133 и ZH3 DSM 9446 соответственно содержат сходные плазмиды pME2001 (Meile et al., 1983) и pME2200 (Stettler et al., 1994), полные нуклеотидные последовательности которых длиной 4440 и 6205 п.н. соответственно, были определены ранее (Bokranz et al.; 1990, Luo et al., 2001).
Мы идентифицировали новую архейную плаз-миду, названную pMTB1, в метагеноме микробного сообщества подземных термальных вод Западной Сибири и представили результаты анализа нук-леотидной последовательности этой плазмиды в сравнении с ранее описанными плазмидами pME2001 и pME2200 из M. marburgensis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения биомассы микроорганизмов, обитающих в подземных термальных водах, через
Рис. 1. Расположение уникальных и гомологичных участков в плазмидах рМЕ2001, рМТВ1 и рМЕ2200. Жирные стрелки и цифры (1—6) — предсказанные гены (ОРС); градация серого — степень идентичности нуклеотидных последовательностей; двухконечные стрелки — инсерционные фрагменты (ТП—Шб).
фильтр с диаметром пор 0.22 мкм было отфильтровано ~40 л воды на выходе из нефтепоисковой скважины 3Р Парабельского р-на Томской обл. Из собранных на фильтре микроорганизмов был выделен препарат метагеномной ДНК (~1 мкг) методом, включающим в себя обработку лизиро-ванных клеток протеазой с последующей экстракцией полисахаридов детергентом цетилтри-метиламмониумбромидом (СТАВ) (Wilson, 2001).
Для определения нуклеотидных последовательностей микробного метагенома создавали библиотеку случайных фрагментов геномной ДНК и проводили ее пиросеквенирование на геномном анализаторе GS FLX с использованием набора реактивов GS XLR70 Sequencing Kit (Roche, Швейцария). Всего было получено 1.8 млн последовательностей средней длиной 380 н.; объем секвенирования составил 686 млн н.
Сборку последовательностей отдельных чтений в объединяющие их протяженные контиги осуществляли с помощью программы GS De Novo Assembler (Roche). Контиг, соответствующий новой плазмиде pMTBl, был идентифицирован в результате сравнения полученного набора конти-гов с базой данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) с помощью программы BLASTN. Идентификацию генов 16S рРНК в контигах осуществляли с помощью программы RNAmmer (Lagesen et al, 2007).
Поиск открытых рамок считывания (ОРС), способных кодировать белки, осуществляли с помощью программы Clone Manager 6. Для предсказания функций белков соответствующие аминокислотные последовательности сравнивали с базой данных NCBI с помощью программы BLASTP. Поиск функциональных мотивов в аминокислотных последовательностях проводили c помощью он-лайн-сервисов NPS (http://npsa-pbil.ibcp.fr) и In-terProScan (Quevillon et al., 2005). В качестве объектов для сравнительного геномного анализа использовали нуклеотидные последовательности
плазмид рМЕ2001 (ОепВапк N^002125) и рМЕ2200 (ОепВапк N^000905). Отметим, что нуклеотидная последовательность рМЕ2001 содержит ошибку — делецию одного нуклеотида (А) в положении 1215 (Ьио et al., 2001); при проведении сравнительного анализа она была учтена. Выравнивание нуклеотидных последовательностей рМТВ1, рМЕ2001 и рМЕ2200 проводили с помощью программы ВЬА8Т^ Полная нуклеотидная последовательность плазмиды рМТВ1 депонирована в ОепВапк (СР006848).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение нуклеотидной последовательности новой плазмиды. Пиросеквенирование метагеномной ДНК микробного сообщества подземных термальных вод, вытекающих из нефтепоисковой скважины, выявило наличие кольцевого контига длиной 4935 н., нуклеотидная последовательность которого почти на всей длине имела высокую гомологию с последовательностями плазмид рМЕ2001 и рМЕ2200 из метаногенной археи M. marburgensis (рис. 1). Новую плазмиду назвали рМТВ1. В метагеноме был также обнаружен контиг, включающий в себя ген 168 рРНК, на 99.6% идентичный последовательности гена 168 рРНК M. marburgensis. С учетом того что последовательности генов 168 рРНК других архей в метагеноме выявлены не были, можно сделать вывод, что новая плазмида рМТВ1, по-видимому, содержится в одном или нескольких близких штаммах M. mar-burgensis, присутствующих в исследуемом микробном сообществе.
Поскольку при пиросеквенировании чтение геномных последовательностей осуществляется с многократной избыточностью (т.е. каждая точка в контигах читается в нескольких независимых реакциях), сравнение кратности прочтения последовательности плазмиды и хромосомного гена 168 рРНК в метагеноме позволяет оценить число
238
КАДНИКОВ и др.
копий плазмиды. Так, средняя кратность чтения гена 16S рРНК M. marburgensis составляла 4.7, а плазмиды pMTBl — 8.8 раза. Поскольку в геноме M. marburgensis Marburg, для которого определена полная геномная последовательность (Liesegang et al., 2010), имеются две копии гена 16S рРНК, можно предположить, что плазмида pMTBl низ-кокопийная (~4 копии на хромосому).
Кодируемые плазмидой pMTBl белки и их вероятные функции. Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pMTBl позволил идентифицировать шесть ОРС (рис. 1), которые могут кодировать белки. Пять генов образуют кластер, в котором гены 1 и 2, а также 2 и 3 перекрываются на несколько нуклеотидов, гены 3 и 4 разделены пятью нуклеотидами, а участок между генами 4 и 5 составляет 11 нуклеотидов. Стартовым кодонам генов 1—4 и 6 предшествуют последовательности, сходные с консенсусной последовательностью AGGAGGTGATC сайта связывания рибосом M. marburgensis (Brown et al., 1989). Близкие гомологи всех шести предсказанных генов имеются в геномах плазмид pME2001 и pME2200.
Предсказанный продукт гена 3 содержит 801 аминокислоту (а.к.) и соответствует белку того же размера, кодируемому в плазмиде рМЕ2200. Продукт гена 3 плазмиды рМЕ2001 содержит 804 а.к. вследствие вставки девяти нуклеотидов. Кодируемый геном 3 белок содержит мотив helix—turn— helix (НТН) (Dodd, Egan, 1990), а также АТФ/ГТФ-связывающий (NTP) мотив, характерные для белков, участвующих в процессах репликации ДНК. НТН-мотив обеспечивает специфическое связывание содержащих его белков с регу-ляторными участками ДНК (Dodd, Egan, 1990). Он имеется во многих белках, обеспечивающих инициацию репликации бактериальных плазмид (del Solar et al., 1998). NTP-мотив обнаруживается в различных АТФ- и ГТФазах, участвующих в процессах метаболизма ДНК, в том числе в хели-казах, белках системы сегрегационной стабильности плазмид и хромосом (ParA/SopA), а также в МСМ — белках, участвующих в процессах инициации репликации хромосом у эукариот. Таким образом, ген 3, вероятно, кодирует репликацион-ный Rep-белок, который специфически связывается с сайтом инициации репликации и участвует в процессе репликации плазмидной ДНК. Такая же функция была ранее предположена для его гомологов в плазмидах pME2001 и pME2200 (Luo et al., 2001).
В настоящее время неизвестно, по какому механизму происходит репликация pMTB1, pME2001 и pME2200. Ранее было предположено, что репликация плазмид pME2001 и pM
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.