научная статья по теме ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА РЕВЕРТАЗЫ РЕТРОТРАНСПОЗОНА BOV-B LINE У ЯЩЕРИЦ ПАРТЕНОВИДА DAREVSKIA UNISEXUALIS И ДВУПОЛЫХ ВИДОВ D. NAIRENSIS И D. VALENTINI Биология

Текст научной статьи на тему «ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА РЕВЕРТАЗЫ РЕТРОТРАНСПОЗОНА BOV-B LINE У ЯЩЕРИЦ ПАРТЕНОВИДА DAREVSKIA UNISEXUALIS И ДВУПОЛЫХ ВИДОВ D. NAIRENSIS И D. VALENTINI»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 417-421

= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА

УДК 577.215.3:575.86

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА РЕВЕРТАЗЫ РЕТРОТРАНСПОЗОНА BOV-B LINE У ЯЩЕРИЦ ПАРТЕНОВИДА Darevskia unisexualis И ДВУПОЛЫХ ВИДОВ D. nairensis И D. valentini

© 2015 г. С. А. Годакова1'2*, В. И. Корчагин1 , С. К. Семенова1 , М. М. Чернявская1,2,

Г. А. Севастьянова2, А. П. Рысков1

Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 119334 2Московский педагогический государственный университет, Москва, 119991 Поступила в редакцию 07.11.2014 г.

Принята к печати 23.12.2014 г.

Клонированы и секвенированы последовательности участка гена ревертазы (750 п.н.) ретротранспозона Bov-B LINE, составляющие около двух третей его длины, у партеногенетического вида ящериц Darevskia unisexualis и двуполых видов D. nairensis и D. valentini. Показано, что доля транскрипционно активных копий этого гена, не содержащих стоп-кодонов, примерно одинакова у трех видов и составляет около 75% от числа исследованных копий. Уровень внутригеномной дивергенции всех копий невысок и составляет 2.6% у D. unisexualis, 1.9% у D. nairensis и 1.6% у D. valentini. На основании филогенетических реконструкций показано распределение копии D. unisexualis внутри каждого из двух кластеров последовательностей гена ревертазы, характерных для D. nairensis и D. valentini. Этот результат поддерживает мнение о гибридном происхождении D. unisexualis и не исключает возможности участия в этом процессе D. nairensis and D. valentini.

Ключевые слова: ретротранспозоны, Bov-B LINE, ген ревертазы ретротранспозона, партеногенетиче-ские виды ящериц, род Darevskia.

CHARACTERISTICS OF REVERSE TRANSCRIPTASE SEQUENCES OF RETROTRANSPOSON BOV-B LINE OF PARTHENOGENETIC LIZARDS Darevskia unisexualis AND BISEXUAL SPECIES D. nairensis AND D. valentini, by S. A. Godakova1,2*, V. I. Korchagin1, S. K. Semeynova1, M. M. Chernyavskaya12, G. A. Sevast'yanova2, A. P. Ryskov1 ^Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 2Moscow State Pedagogical University, Moscow, 119991 Russia; *email: svetlana_godakova@mail.ru). The cloning and sequencing of partial reverse transcriptase gene (750 bp) of retrotransposon Bov-B LINE have been held in parthenogenetic species Darevskia unisexualis and its assumed bisexual parental species D. nairensis and D. valentini. It was shown that the percentage of transcriptionally active copies is similar in all species and equals about 75%. The divergence of these sequences has been shown to be low and is 2.6% in D. unisexualis, 1.9% in D. nairensis and 1.6% in D. valentini. The phylogenetic analysis supported the hybrid origin of D. uni-sexualis and identified a number of features in the distribution of the RT sequences, which would not exlude the reticulate nature of intraspecific hybridization between bisexual D. nairensis and D. valentini.

Keywords: retrotransposons, Bov-B LINE, reverse transcriptase gene, parthenogenetic lizard species, genus Darevskia.

DOI: 10.7868/S0026898415030052

Ретротранспозоны, мобильные генетические элементы, перемещаются по геному при участии РНК-интермедиатов. Эти мультикопийные последовательности участвуют в рекомбинацион-ных процессах, приводящих к структурным перестройкам генома, существенно изменяющим его стабильность и функционирование. Особенность ретротранспозонов типа LINE — наличие в их со-

* Эл. почта: svetlana_godakova@mail.ru

ставе различных функциональных сайтов, включая ген РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы, ревертазы, ЯТ). Полиморфизм ЯТ-последовательностей используется как для классификации самих мобильных элементов из разных классов, так и для филогенетических реконструкций таксонов различного таксономического ранга [1, 2]. Изучаемый нами ре-

4

417

418

ГОДАКОВА и др.

тротранспозон Bov-B LINE имеет длину примерно 3.2 т.п.н. и относится к суперсемейству, не содержащему длинные концевые повторы (non-LTR RTE). Bov-B LINE вначале обнаружили в семействе полорогих (Bovidae) и считали его специфичным для подотряда жвачных (Ruminantia). Позднее сходный ретротранспозон обнаружили у змеи Vipera ammodytes (гадюки отряда Squamata, сем. Vi-peridae), и его появление в этом семействе объясняли горизонтальным переносом элемента между двумя эволюционно дальними классами, который произошел около 40—50 млн лет назад [3]. В дальнейшем Bov-B LINE обнаружили у ящериц, в том числе рода Anolis (отр. Squamata, сем. Iguanidae) [4]. У А. carolinensis элементы Bov-B Line составляют 0.66% всего генома, а число копий достигает ~30000 [5]. Предполагают, что впервые этот элемент появился у представителей отр. Чешуйчатых (Squamata), а затем распространился среди млекопитающих [3, 6].

Изучение полиморфизма ретротранспозонов, в частности Bov-B LINE, у партеногенетических видов рептилий, возникающих, как полагают, при гибридизации двуполых видов [7], представляет особый интерес. Ретротранспозоны важны и интересны не только при изучении их роли в возникновении геномной нестабильности и собственной эволюционной динамики, но могут использоваться в качестве генетических маркеров для исследования эволюции хозяина, например у разных видов рептилий. Для этих целей удобным объектом служит комплекс видов скальных ящериц р. Darevskia (отр. Squamata, сем. Lacertidae), который хорошо изучен биогеографически и содержит наряду с двуполыми видами ряд однополых партеногенетических форм [8]. Короткие участки ретротранспозона Bov-B LINE ранее обнаружены нами у двуполых и однополых видов ящериц этого рода [9].

В работе клонировали и секвенировали 94 участка (~750 п.н.) последовательности гена RT ретротранспозона Bov-B LINE из трех геномов ящериц — партеновида D. unisexualis и двуполых видов D. valentini и D. nairensis (D. raddei nai-rensis). Впервые показано, что в составе геномов этих трех видов имеются неактивные и потенциально транскрипционно активные копии гена RT. Оценка их внутригеномной дивергенции и результаты филогенетических реконструкций не противоречат высказанному ранее предположению о гибридном происхождении D. unisexualis, полученному на основании сравнения изменчивости аллозимов и полиморфизма мтДНК в группе ящериц рода Darevskia [7].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали три образца ДНК, полученные из крови ящериц D. unisexualis, D. nairensis и D. valentini, отловленных на территории Армении.

Ген RT из Bov-B LINE амплифицировали, используя 20 нг геномной ДНК и вырожденные праймеры ME1_liz (CACAGTARTCCAAGYYTAYR-CMCCAAC) и ME2_liz (CWGCATATCTGAGGT-TRTTGATATTTCT), сконструированные нами на основе известной последовательности Bov-B LINE гадюки обыкновенной (V ammodytes) и специфичные к участку апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы и гена ревертазы ([11], GeneBank, Асс. no AF332691). Использовали набор реактивов GenePak PCR Core ("Изоген", Россия) в объеме 20 мкл при следующем режиме: предварительная денатурация ДНК (95°С — 5 мин); синтез ПЦР-продукта — 35 циклов (денатурация цепей при 95°С — 1 мин, отжиг праймеров при 55°С — 1 мин, элонгация ДНК при 72°С — 1 мин); конечная элонгация (72°С — 5 мин). Продукты амплификации фракционировали путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле, элюировали из геля, очищали, используя набор Wizard SV Gel and PCR Clean-up System ("Promega", США), и лигировали с вектором pGEM, используя набор pGEM-T-easy ("Promega") для секвенирования по протоколу фирмы производителя. Нуклеотидную последовательность вставки определяли по методу Сэнге-ра при помощи набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 ("Applied Biosystems", США) c анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant ("Applied Biosystems").

Всего секвенировано 94 последовательности: 38 — D. unisexualis, 27 — D. nairensis, 29 — D. valentini. Проводили множественные выравнивания последовательностей, используя алгоритм CLUSTALW, и редактировали вручную. Для поиска стоп-кодо-нов, расчета дистанций при парном сравнении последовательностей (минимальное-максимальное расстояние, p-дистанции), а также для построения филогенетических деревьев методом максимального правдоподобия на основании выбранной модели, имеющей минимальные значения критериев AIC и BIC, использовали программу MEGA 6 (http://www. megasoftware.net). В качестве внешней группы использовали последовательности RT Bov-B LINE гадюки обыкновенной (V. аm-modytes, Ass. no AF332691) и зеленой ящерицы (A. сarolinensis, Ass. no FJ158981 и FJ158982). Для выявления гомологий нуклеотидных последовательностей использовали алгоритмы blastn, blastx и tblastx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате ПЦР-амплификации ДНК получены и секвенированы вставки длиной около 1.8 т.п.н., состоящие из участков генов апурино-вой/апиримидиновой эндонуклеазы и RT. Для филогенетического анализа использовали участок длиной около 750 п.н., расположенный ближе к З'-концу последовательности Bov-B LINE и составляющий около двух третей длины гена RT. Длина последовательностей у D. unisexualis варьирует от 712 до 752 п.н., у D. nairensis - от 749 до 753 п.н. и у D. valentini — от 719 до 750 п.н. Различия связаны с наличием инделей разной длины. Большинство из них представлено однонуклео-тидными заменами, однако у клона Dv10 имеется делеция 30 п.н. в самом начале, а у клонов Du4 и Du9 — две делеции (36 и 12 п.н.) в середине гена RT. Некоторые последовательности у каждого из трех видов содержат внутренние стоп-кодоны. Их число варьирует у разных видов и внутри видов, максимальный разброс — в пределах от 1 до 10 — наблюдается у однополого D. unisexualis. Однако соотношение между числами потенциально активных копий, не содержащих стоп-кодонов (20, 21 и 29 копий соответственно, таблица), и неактивных копий практически одинаково у трех видов — примерно 3 : 1 в каждом из них.

Для подтверждения принадлежности последовательностей генов RT трех видов ящериц р. Darevskia к семейству Bov-B LINE предприняты поиски гомологичных участков в базе данных нуклеиновых кислот с помощью трех алгоритмов BLAST Максималь

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком