научная статья по теме ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ NICOTIANA TABACUM, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГИБРИДНЫЕ ГЕНЫ 9- ИЛИ 12-АЦИЛ-ЛИПИДНЫХ ДЕСАТУРАЗ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЛИХЕНАЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ NICOTIANA TABACUM, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГИБРИДНЫЕ ГЕНЫ 9- ИЛИ 12-АЦИЛ-ЛИПИДНЫХ ДЕСАТУРАЗ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЛИХЕНАЗЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 3, с. 307-316

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ Nicotiana tabacum, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГИБРИДНЫЕ ГЕНЫ А9- ИЛИ А12-АЦИЛ-ЛИПИДНЫХ ДЕСАТУРАЗ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЛИХЕНАЗЫ

© 2015 г. И. М. Герасименко*, Л. А. Сахно*, Т. Н. Кирпа*, А. Н. Остапчук**, Т. А. Хаджиев***,

И. В. Голденкова-Павлова***, Ю. В. Шелудько*

*Институт клеточной биологии и генетической инженерии Национальной академии наук Украины, Киев **Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного

Национальной академии наук Украины, Киев ***Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 15.10.2014 г.

Получены трансгенные линии растений Nicotiana tabacum, экспрессирующие гибридный ген Д12-ацил-липидной десатуразы Synechocystis sp. PCC 6803 и гибридный ген Д9-ацил-липидной десатура-зы Synechosystis vulcanus, слитый с последовательностью, кодирующей транзитный пептид малой субъединицы РБФК Arabidopsis thaliana и без лидерного сигнала под контролем конститутивного промотора. У трансгенных растений, экспрессирующих ген Д12-десатуразы, продемонстрировано достоверное увеличение доли линолевой (Д9,12-18:2) и уменьшение уровня а-линоленовой (Д9,12,15-18:3) кислоты. При экспрессии гена Д9-десатуразы с лидерным пептидом у трансформантов растений отмечено достоверное увеличение доли а-линоленовой кислоты с уменьшением уровня линолевой кислоты, а также увеличение индекса ненасыщенности (ИН) в отличие от трансформантов растений, экспрессирующих ген Д9-десатуразы без лидерного пептида, у которых достоверных изменений в составе жирных кислот (ЖК) и ИН не выявлено. Изменений доли Д9-мононенасыщенных ЖК не обнаружено ни у одной из исследованных линий трансгенных растений. В условиях низкотемпературного воздействия у трансгенных растений, экспрессирующих гены десатураз, увеличивалась активность супероксиддисмутазы (СОД), в отличие от контрольных линий, у которых такое воздействие приводило к уменьшению активности СОД.

Ключевые слова: Nicotiana tabacum — Synechocystis sp. PCC 6803 — Synechococcus vulcanus — Clostridium thermocellum — ацил-липидные десатуразы — лихеназа — жирные кислоты — трансгенные растения

DOI: 10.7868/S0015330315030070

ВВЕДЕНИЕ

Десатурация жирных кислот (ЖК) является ключевой реакцией, определяющей физические свойства глицеролипидов мембран. Известно, что уровень ненасыщенных жирных кислот (ЖК)

Сокращения: АПБ — ацил-переносящий белок; КоА — ко-фермент А; СОД — супероксидцисмутаза; СРБ — суммарный растворимый белок; GFP — зеленый флуоресцентный белок (от Green Fluorescent Protein); RTP — транзитный пептиц малой субъединицы РБФК (от Rubisko Transit Peptide). Адреса для корреспонденции: Шелудько Юрий Всеволодович. Украина, 03143 Киев, ул. Заболотного, 148. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Факс: +38 (044) 526-7104; электронная почта: ysheludko@ukr.net. Голденкова-Павлова Ирина Васильевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-80-18; электронная почта: irengold58@gmail.com

мембранных липидов является важной частью адаптивного ответа растений на абиотические и биотические факторы среды, прежде всего за счет стабилизации структуры и функционирования мембранных белковых комплексов, включая электронно-транспортные цепи, при воздействии стрессовых факторов [1].

В растительной клетке десатурация ЖК происходит при участии двух групп ферментов — ацил-АПБ-десатураз и ацил-липидных десатураз [2]. Ацил-АПБ-Д9-десатуразы функционируют в пластидах и катализируют образование первой двойной связи в насыщенных ЖК (С16:0 и С18:0). Дальнейшая десатурация мононенасыщенных ЖК происходит в мембранах пластид или эндо-плазматического ретикулума за счет функционирования мембраносвязанных ацил-липидных де-

сатураз, которые используют в качестве субстрата этерифицированные ЖК в составе глицеролипи-дов. В результате образуются ди- и триненасы-щенные ЖК с двойными связями в Д12- и Д12,15-положениях. Кроме ферментов, катализирующих эти реакции, описаны и другие десату-разы, вводящие двойные связи в Д4-, Д6- и другие положения алифатической цепи ЖК [3].

У цианобактерий за образование ненасыщенных ЖК ответственны мембраносвязанные ацил-липидные десатуразы. Двойные связи в Д9-, Д12-, Д15- и Д6-положения цепи ЖК вводят четыре белка — DesC, DesA, DesB и DesD соответственно. В первой реакции десатурации DesC превращает стеариновую кислоту (С18:0) в олеиновую (С18:1). Образование линолевой кислоты (С18:2) катализируется десатуразой DesA. В дальнейшем двойные связи могут быть введены в Д15- и/или в Д6-положение ЖК [2].

Для выяснения роли ацил-липидных десатураз в молекулярных механизмах адаптивного ответа растений необходимы данные о том, как изменится состав и ненасыщенность ЖК мембранных липидов в зависимости от локализации десатураз в клетке. Хотя в ряде публикаций описаны десатуразы растений, гомологичные Д9-ацил-липид-ным десатуразам цианобактерий [4, 5], экспериментальные данные о взаимосвязи локализации этих ферментов и их функциональной эффективностью весьма ограничены. Так, важно определить, возможна ли внепластидная десатурация ЖК Д9-десатуразой. Для этого необходимо провести сравнительное исследование растений, у которых гетерологичная Д9-десатураза будет локализована либо в хлоропластах, либо в цитоплазме. Добиться такого результата можно за счет переноса и экспрессии чужеродного гена Д9-де-сатуразы с сигналом хлоропластной локализации и без такого сигнала. Следует подчеркнуть, что дополнительную информацию о функциональной роли десатураз в растительной клетке и их влиянии на ЖК-состав мембранных липидов может дать экспрессия в растительных клетках гете-рологичного гена, кодирующего Д12-десатуразу. Хотя гетерологическая экспрессия генов некоторых десатураз в растениях была ранее уже описана (например [6, 7]), эти исследования были проведены на разных видах растений, что усложняет оценку вклада той или иной десатуразы в изменение состава ЖК липидов мембран.

В настоящей работе представлены результаты экспрессии двух генов гетерологичных ацил-ли-пидных десатураз, белковые продукты которых локализованы в разных внутриклеточных ком-партментах (хлоропластах и цитоплазме) модельного растения Nicotiana tabacum, а также результаты сравнительного анализа ЖК-состава липидов мембран и оценки ответа антиоксидантной си-

стемы растений при воздействии низких температур. Для оценки уровня накопления гетероло-гических белков нами использован подход, основанный на переносе гибридных генов, у которых последовательности целевых генов трансляцион-но слиты с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы Clostridium ther-mocellum. Как было показано ранее, такой подход позволяет точно определять уровень накопления рекомбинантного продукта и в большинстве случаев с сохранением функциональности целевого белка [8, 9].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Генетические конструкции. В работе использовали ген desC, кодирующий ацил-липидную Д9-десатуразу Synechococcus vulcanus [10] и ген desA, кодирующий ацил-липидную Д12-десату-разу Synechocystis sp. PCC 6803 [11], слитые с оптимизированной версией licBM3 [9] репортер-ного гена термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum [12].

Гибридные гены desA::licBM3 и desC::licBM3 клонировали в экспрессионные векторы на основе pBISN (с селективным геном nptII) под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35S РНК CaMV) [9]. 5'-Конце-вая область гена desC::licBM3 была слита в рамке считывания с последовательностью, кодирующей транзитный пептид малой субъединицы РБФК (RTP) Arabidopsis thaliana (ген ats1A, NCBI, X13611). Полученную рекомбинантную молекулу RTP::desC::licBM3 клонировали под контроль промотора 35S РНК CaMV в бинарный вектор с селективным геном bar. В качестве контроля получали трансгенные растения с аналогичными векторными конструкциями, несущими гибридный репортерный ген gfp::licBM3.

Генетическая трансформация и регенерация растений. Получение линий растений, несущих гибридные гены desA::licB M3 или desC::licBM3, проводили по методу, описанному ранее [13]. Для остальных линий экспрессионные векторы введены в штамм GV3101 Agrobacterium tumefaciens. Трансформацию Nicotiana tabacum (сорт Wisconsin) проводили методом ко-культивирования листовых дисков с суспензией агробактерий, несущих соответствующие векторы. Регенерацию растений проводили на среде MS, содержавшей 20 г/л сахарозы, 1 мг/л БАП ("Sigma"), 0.1 мг/л НУК ("Sigma"), 500 мг/л цефотаксима, а также 5 мг/л фосфиноторицина (приготовленного из раствора BASTA ("Bayer")) как селективный агент. Регенерированные растения переносили на среду MS, содержавшую 20 г/л сахарозы и 10 мг/л фосфиноторицина, поддерживали in vitro при 25 ± ± 1°C, 16-часовом фотопериоде, освещенности 100 мкмоль квантов/(м2 с) и временем культиви-

рования 30-45 дней до молекулярного анализа. Отобранные трансформанты далее культивировали, как описано выше, на среде MS, содержавшей 30 г/л сахарозы, без антибиотиков и селективных агентов. Для молекулярного и биохимического анализа использовали растения, которые культивировали in vitro 4-5 недель.

ПЦР анализ трансгенных растений. Присутствие последовательностей целевых гетерологич-ных генов в геноме отобранных трансформантов растений подтверждали методом мультиплексной ПЦР, как было описано ранее [14].

Экстракция белков и определение активности лихеназы. Для приготовления экстрактов суммарных растворимых белков (СРБ) фрагменты листьев (100-300 мг) гомогенизировали в двойном объеме буфера, содержавшего 0.1 М Tris-HCl (pH 8.0), 0.005 M Na2EDTA, 0.1 M NaCl и 0.01 M Р-меркаптоэтанол. Концентрацию белка определяли по методу Bradford [15], используя калибровочную кривую, построенную для стандартных растворов БСА ("Fermentas").

Уровень накопления гибридных белков DesC-LicBM3 и DesA-LicBM3 оценивали по активности лихеназы, используя в качестве субстрата ли-хенан ("Megazyme", Германия). Опред

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком