БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 3, с. 363 - 371
УДК 577.151
ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ PPrЗАВИСИМЫХ 6-ФОСФОФРУКТОКИНАЗ ИЗ Methylosinus trichosporium OB3b И Methylobacterium nodulans ORS 2060
© 2012 г. О.Н. Розова, В.Н. Хмеленина*, Ю.А. Троценко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290Пущино Московской обл., просп. Науки, 5; факс: (495)956-3370, электронная почта: khmelenina@rambler.ru
Поступила в редакцию 23.06.11 После доработки 30.08.11
Определены свойства рекомбинантных РРгзависимых 6-фосфофруктокиназ (ПФК) метанотрофа Methylosinus trichosporium OB3b и ризосферного фитосимбионта Methylobacterium nodulans ORS 2060. Зависимости активности ПФК-Hisg Ms. trichosporium (6 • 45 кДа) и ПФК Mb. nodulans (4 • 43 кДа) от концентраций субстратов прямой и обратной реакций подчинялись кинетике Михаэлиса—Ментен. Кроме фруктозо-6-фосфата ферменты фосфорилировали седогептулозо-7-фосфат. ADP или AMP в концентрации 1 мМ подавляли активность ПФК Ms. trichosporium, но не ингибировали активность фермента из Mb. nodulans. ПФК ме-тилотрофных бактерий предпочитает фруктозо-1,6-бисфосфат, что указывает на доминирующую роль ферментов в синтезе фосфогексоз. ПФК этих метилотрофов имеют низкое сходство транслированных аминокислотных последовательностей (17% идентичности) и филогенетически принадлежат к различным подгруппам 6-фосфофруктокиназ типа II. Обсуждается связь ПФК с микроаэрофильной природой метанотрофа Ms. trichosporium OB3b и адаптацией Mb. nodulans ORS 2060 к анаэробным условиям фитосимбиоза.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа, метилотрофные бактерии, седогепту-лозо-1,7-бисфосфатаза, гликолиз, глюконеогенез.
Ключевую стадию гликолиза — фосфорили-рование фруктозо-6-фосфата (Фр-6-Ф) до фрук-тозо-1,6-бисфосфата (ФБФ) — у большинства организмов катализирует аллостерически регулируемая ATP-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ATP-ФФК; КФ 2.7.1.11). Однако у ряда про- и эукариот, в том числе фототрофных бактерий (Rhodospirillum rubrum), анаэробов, паразитических микроорганизмов (Treponema pallidum, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis), Euglena gracilis, а также высших растений, имеется пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа (ПФК; КФ 2.7.1.90), гомологичная ATP-ФФК [1]. Реакция, катализируемая ПФК, обратима, что предполагает участие данного фермента как в гликолизе, так и в глюконеогенезе.
Принятые сокращения: ИПТГ — изопропил-P-D-тиогалактопиранозид, ПФК — пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа, РМФ — рибулозомонофосфат, Ру-бисКО — рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигена-за, С-7-Ф — седогептулозо-7-фосфат, СБФаза — седогепту-лозо-1,7-бисфосфатаза, Фр-6-Ф — фруктозо-6-фосфат, ФБФ — фруктозо-1,6-бисфосфат, ФФК — 6-фосфофрукто-киназа, ФРК — фосфорибулокиназа, LB — среда Лурия— Бертани.
* Адресат для корреспонденции.
Причины и метаболические следствия замены ATP на PPj в ключевой реакции гликолити-ческой последовательности неясны. Предложены альтернативные гипотезы, в которых присутствие ПФК рассматривается как проявление «ископаемого метаболизма», сохранившегося в качестве рудимента у небольшого числа видов, или, напротив, как результат мутаций ATP-за-висимых ферментов, что было адаптивным приспособлением к анаэробным условиям
[1-3].
ПФК была обнаружена у облигатных мета-нотрофов - специализированной группы аэробных бактерий, использующих метан как источник углерода и энергии и не способных к росту на полиуглеродных субстратах, а также у небольшого числа факультативных метилобакте-рий, растущих на метаноле и на некоторых углеводных субстратах [4-6].
У метано- и метилотрофных бактерий функционируют три основных циклических пути первичной ассимиляции Сгсоединений и синтеза клеточных компонентов. В рибулозомоно-фосфатном (РМФ) пути при конденсации формальдегида и рибулозо-5-фосфата в качестве первичного продукта образуется гексулозо-6-
фосфат. При этом для синтеза С3-соединений у метанотрофов с РМФ-циклом реализуются два пути распада С6-фосфосахаров: Энтнера-Дудо-рова и Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз). У метилотрофов с сериновым путем первичным продуктом биосинтеза является С3-со-единение (серин), образующееся при конденсации формальдегида и глицина. Некоторые ме-тилотрофные бактерии ассимилируют восстановленные Сгсоединения, после их окисления до СО2, через цикл Кальвина, в котором в качестве первичного стабильного интермедиата образуется 3-фосфоглицерат. Термотолерантные метанотрофы родов Methylococcus и Methylocaldum ассимилируют Сгсоединения посредством трех перечисленных путей, функционирующих одновременно [7-9]. Таким образом, в зависимости от реализуемого пути Сгассимиляции функциональные значения гликолиза/глюконеоге-неза у метилотрофов различаются. Следовательно, эти бактерии - удобные модельные организмы для выяснения роли ПФК в углеродном метаболизме.
Ранее ПФК были охарактеризованы нами у метанотрофов с РМФ-циклом (Methylomonas methanica 12 и Methylomicrobium alcaliphilum 20Z), а также у Methylococcus capsulatus Bath [10-13]. На основании различий свойств ферментов и результатов анализа секвенированных геномов этих бактерий предположено несколько важных функций ПФК в углеродном и энергетическом метаболизме. Однако у метилотрофов с сериновым путем этот фермент не изучался.
Цель данной работы - очистка и характеристика рекомбинантных ПФК из облигатного ме-танотрофа Methylosinus trichosporium OB3b и факультативного фитосимбионта Methylobacterium nodulans ORS 2060, ассимилирующих С1-соеди-нения сериновым путем.
миды, добавляли ампициллин и хлорамфеникол в концентрации 100 мкг/мл.
Клонирование генов pfp и очистка ПФК. Хромосомные ДНК из Mb. nodulans и Ms. trichosporium выделяли описанным ранее методом [16]. Ген pfp из Mb. nodulans ORS 2060 (Mnod_0681) амплифицировали с помощью ПЦР и с использованием праймеров PFKnod-N и PFKnod-C (табл. 1), сконструированных на основе доступной в GenBank последовательности (NC_011894). ПЦР-Продукт клонировали в экспрессионный вектор pHUE, позволяющий получать гетероло-гичный белок, слитый с убиквитином [17]. Полученную плазмиду pHUE:pfpnod трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3), несущий дополнительную плазмиду pT-groE. Трансформированные клетки E. coli выращивали в течение ночи при 37° в среде LB, переносили в свежую среду LB, содержавшую 100 мкг/мл ампициллина и хлорамфеникола, и выращивали до А600 = 0,6—0,7. Экспрессию белка индуцировали изопропил-ß-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) в конечной концентрации 1 мМ. После инкубации при 27° в течение 5 ч клетки осаждали центрифугированием при 4° (6000 g, 20 мин) и хранили при —20°. His^Ub-ПФК очищали аффинной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA, как описано ранее [11]. После обработки деубиквитинирующим ферментом Usp2-His6 в течение 1 ч при 4° ПФК хранили в 40%-ном глицерине при —20°. Перед использованием раствор фермента диализовали против 20 мМ буфера Tris-HCl, pH 8,0, содержавшего 0,5 M NaCl, и снова хроматографиро-вали на колонке с Ni2+-NTA.
Ген pfp (EFH03142) Ms. trichosporium OB3b амп-лифицировали с хромосомной ДНК с использованием праймеров pfkOB3b-N и pfkOB3b-C (табл. 1), сконструированных на основе доступ-
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактерии и условия культивирования. Ms. trichosporium OB3bT выращивали в атмосфере метана и воздуха (1 : 1) на минеральной среде П при 28° и постоянном перемешивании (200 об/мин) [14]. Mb. nodulans ORS 2060Т культивировали в колбах с минеральной средой К, содержавшей (г/л) KH2PO4 (2,0), (NH4)2SO4 (2,0), NaCl (0,5), MgSO4 ■ 7H2O (0,025), FeSO4 ■ 7H2O (0,002), pH 7,2, с добавлением метанола (0,5%) или L-ара-бинозы (1 г/л) при 28° на роторной качалке (200 об/мин) [15]. Escherichia coli BL21(DE3) выращивали в жидкой среде Лурия—Бертани (LB) при 37° в качалочных колбах (150 об/мин). При выращивании клеток E. coli, содержавших плаз-
Таблица 1. Использованные праймеры
Праймер Нуклеотидная последовательность (5'-3')
PFKnod-N TAG GATCCATGACCACAGCCAAAGT
(BamHI)
PFKnod-C
TCAAGCTTAGGCGTGCGGCTGCCCGAT
pfkOB3b-N (HindIII)
pfkOB3b-C TTCATATGTCCGACATCGACTTCTCCAA
(AdfeI)
TTAAGCTTCTTTTTCAAAATCTTGGCGACAT
(HindIII)
Примечание. Подчеркнуты сайты узнавания для эндонук-леаз рестрикции, указанных в скобках.
ной в GenBank последовательности (ADVE010-00022). ПЦР-Продукт клонировали в экспресси-онный вектор pET22b+. Полученную конструкцию pET22b:pfpOB3b трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3), несущий плазмиду pT-groE. Трансформированные клетки E. coli выращивали в течение ночи при 37° в среде LB, переносили в свежую среду LB, содержавшую 100 мкг/мл ампициллина и хлорамфеникола, и выращивали до ^600 = 0,6—0,7. Для экспрессии белка в культуру вносили 1 мМ ИПТГ и инкубировали при 18° в течение 10 ч. Клетки осаждали центрифугированием (6000 g, 20 мин) и хранили при —20°. РРГПФК-Н186 очищали аффинной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA. Фермент хранили в 3,2 M растворе (NH4)2SO4 при 4°. Перед использованием аликвоту фермента диа-лизовали против 20 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,5.
Очищенные ферменты анализировали электрофорезом в 12%-ном Ds-Na-ПААГ [18]. В качестве маркерных белков использовали ß-га-лактозидазу (116,0 кДа), БСА (66,2 кДа), оваль-бумин (45,0 кДа), лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), рибонуклеазу Bsp98I (25,0 кДа), ß-лактоглобу-лин (18,4 кДа) и лизоцим (14,4 кДа).
Определение молекулярной массы ПФК. Для определения молекулярных масс нативных ферментов проводили неденатурирующий гель-электрофорез с использованием пороограничи-вающего градиента полиакриламида (4—30%) [19] и набора белковых маркеров («Pharmacia», США), включавшего в себя ферритин (440 кДА), каталазу (232 кДа), лактатдегидрогеназу (140 кДа), БСА (67 кДа). Для фермента из Ms. trichosporium OB3b проводили гель-фильтрацию на колонке с сорбентом Ultrogel AcA 34, уравновешенной с 20 мМ буфером Tris-HCl, рН 7,2, содержавшим 100 мМ NaCl. В качестве маркеров использовали ферритин, амилазу (200 кДа), алкогольдегид-рогеназу (150 кДа) и БCА(«Sigma», США).
Определение активности ПФК. Активность ПФК в прямой и обратной реакциях определяли по образованию ФБФ или Фр-6-Ф соотве
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.