МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 437-441
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 575:579.852
ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ РЕПЛИКАЦИИ ПЛАЗМИД ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ Bacillus subtilis
© 2004 г. А. В. Лагодич*, Я. В. Штанюк, А. А. Прозоров1, М. А. Титок
Белорусский государственный университет, Минск, 220050, Беларусь 1Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 20.11.2003 г.
С помощью методов рестрикционного анализа, клонирования и секвенирования показано, что выделенные из штаммов Bacillus subtilis крупные плазмиды (более 90 т. п. н.) имеют идентичную организацию областей, которые ответственны за процессы наследования плазмидных репликонов и широко представлены в штаммах B. subtilis, выделенных из различных природных источников на территории Беларуси.
Ключевые слова: плазмиды Bacillus subtilis, репликон, клонирование.
Плазмиды бактерий, имеющие сходные системы репликации, относятся к одной группе несовместимости. Отличительной их особенностью является неспособность совместно существовать в одной бактериальной клетке [1]. Несмотря на сходство систем репликации, плазмиды одной классификационной группы, как правило, отличаются по размерам и по наборам генетических детерминант, входящих в их состав. Кроме того, базовый репликон, включающий область начала вегетативной репликации - "ориджин" и локус, кодирующий белок инициации репликации, также могут быть полиморфны по последовательности ДНК [2].
В литературе описаны случаи, когда из клеток таксономически различающихся штаммов бактерий выделяли абсолютно одинаковые плазмиды. В частности, посредством рестрикционного картирования и гетеродуплексного анализа установлена идентичность плазмид RP4, RP1, R68, выделенных из клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa, и плазмиды RK2 из клеток Klebsiella aerogenes [3, 4], которые принадлежат к IncPla-группе несовместимости. Идентичны организация генома и расположение сайтов рестрикции у плазмид RSF1010, R1162 и R300B, выделенных из различных бактерий семейства Enterobacteriaceae и относящихся к IncQ-группе несовместимости [5]. Распространение сходных внехромосомных элементов среди природных бактериальных штаммов может быть следствием особенностей их систем репликации, а также тем, что в них имеются генетические детерминанты (tra- и mob-ге-нов), которые обеспечивают горизонтальное и вертикальное распространение плазмидных реп-
* Эл. почта: LagodichAV@bsu.by
ликонов, циркулирующих в среде природных штаммов бактерий.
Целью настоящей работы является сравнительный анализ систем репликации плазмид сходного размера (более 90 т. п. н.), часто встречающихся в клетках штаммов B. subtilis, выделяемых из различных природных источников на территории Беларуси.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали 55 штаммов B. subtilis, выделенных на территории Беларуси, а также типовой штамм B. subtilis 168 trpC2 (предоставлен A.A. Прозоровым) и E. coli xl-1 Blu F' proAB lac lacZ AM15 Tn10(TcR), recAl, endAl, gurA96(NalR), thil, hsd, R17 (r~m+), supE44, relAllac (предоставлен E.A. Николайчиком). Для клонирования ми-нирепликонов и продуктов амплификации их областей репликации (rep) использовали плазмиду pMTL21C [6], для клонирования фрагментов ДНК с их последующим секвенированием использовали вектор pUC19 [7].
Бактериальные культуры выращивали в жидких и на плотных питательных средах LB [8] либо на минимальной среде, предложенной ранее [9]. Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0.2% (для E. coli) и 0.5% (для B. subtilis). В работе использовали коммерческие препараты антибиотиков ампициллина (Ар) в конечной концентрации 50 мкг/мл и хлорамфенико-ла (Cm) в конечной концентрации 5 мкг/мл.
IPTG и X-Gal производства "MBI Fermentas" (Литва) готовили согласно рекомендациям изготовителя и использовали в конечных концентра-цях 0.5 мМ и 50 мкг/мл соответственно.
1 2 3 4 5 6 7 8
а —
BSl-прямой 5'-GCT AGC TTG ACT TTA GGG ACC CTG-3'
BS2-o6paTHbm 5'-GCT AGC AAA TTC TGG CAG CAT CC-3'
Для реакции секвеиироваиия ДНК использовали набор CycleReader™ Auto DNA Sequencing Kit производства "MBI Fermentas" (Литва). Последовательность ДНК определяли с помощью автоматического секвенатора (ALFexpress II). Результаты анализировали с использованием компьютерных программ BLASTP2.2.1 (NCBI сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ALFwintm Sequence Analyser (version 2.10).
Рис. 1. Электрофореграмма плазмидной ДНК, выделенной из природных штаммов B. subtilis: 1 - штамм BS57 (выделен на р. Бобрик, Брестская обл); 2 -штамм BSN1 (выделен на оз. Нарочь, Минская обл.);
3 - штамм BS2 (выделен на оз. Нарочь, Минская обл);
4 - штамм BS4 (выделен на оз. Рисловское, Гомельская обл.); 5 - штамм BS8 (выделен на лугу, Гродненская обл); 6 - штамм BS15 (выделен на оз. Рисловское, Гомельская обл.); 7 - штамм BS19 (выделен в лесу, Гродненская обл.); 8 - штамм BS72 (выделен на клумбе, г. Минск): а, в - плазмидная ДНК; б - хромосомная ДНК.
Тотальную ДНК выделяли с помощью стандартных методов [8].
Плазмидную ДНК выделяли, используя метод щелочного лизиса с некоторыми модификациями [10]. Трансформацию бактерий E. coli и B. subtilis, после перевода клеток в состояние компетентности, проводили согласно рекомендациям, приведенным в руководствах Сэмбрука и соавт. [8] и в работе Брона [11] соответственно.
Рестрикцию плазмидной ДНК, обработку фо-сфатазой и лигирование осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой изготовителем ферментов ("MBI Fermentas", Литва).
Электрофоретический анализ проводили как описано [8]. Размер фрагментов ДНК определяли по их электрофоретической подвижности в ага-розном геле, в качестве реперной ДНК использовали Lambda DNA/HindlII Marker 2 либо GeneRu-lerTM 1kb DNA Ladder ("MBI Fermentas", Литва).
Фрагменты ДНК выделяли из геля как описано в руководстве [8].
Клонирование гер-областей плазмид природных штаммов B. subtilis и проверку стабильности наследования плазмид осуществляли способом, описанным ранее [10].
Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: 94°С - 5 мин (один цикл); 94°С - 10 с, 50°С - 15 с, 65°С - 4 мин (30 циклов), с использованием набора фирмы "Takara" (Япония). В качестве праймеров использовали последовательности:
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В пределах нуклеотидной последовательности ранее клонированного и секвенированного мини-репликона (3081 п. н.) крупной плазмиды рВБ72 (более 90 т. п. н.) природного штамма В. зиЫШз обнаружено четыре открытых рамки считывания. Для копирования этого минирепликона необходима функция гена, начинающегося с ог[1, и "ориджин" вегетативной репликации, расположенный в межгенной области между открытыми рамками считывания ог[1 и ог/2. Путем анализа секвенированной последовательности выявили, что между С-терминальной последовательностью белка, кодируемого ог[1 (271 аминокислотный остаток), и К-терминальной последовательностью белка БпаА бактерий, участвующего в инициации репликации хромосомы [12, 13], имеется достоверная гомология. Однако при сравнении последовательности минирепликона плазмиды рВБ72 ее сходства с гер-областями ранее изученных плазмид [14-16] грамположительных и грамотрицательных бактерий выявить не удалось. Можно предположить, что эта плазмида уникальна и принадлежит к новому классу вне-хромосомных бактериальных элементов. Кроме того, при репликации данной плазмиды интерме-диаты в виде одноцепочечных ДНК не обнаружены, что может свидетельствовать о репликации плазмиды рВБ72 по механизму тета-типа. Способность клонированного репликона рМТЬВ872 наследоваться в клетках В. зиЫШз ро1А~ свидетельствует о том, что начальные стадии репликации этого внехромосомного элемента не зависят от функции ДНК-полимеразы I [10, 17].
С помощью метода щелочного лизиса клетки 55 природных штаммов В. зиЫШз были проверены на наличие в них внехромосомных элементов. Совершенно неожиданно оказалось, что в клетках семи штаммов, происходящих из различных природных источников, имеются плазмиды, по молекулярной массе сходные с плазмидой рВБ72 (рис. 1). Представляло интерес изучить системы их репликации в сравнении с плазмидой рВБ72.
rep pBS72 rep pBS57
Bgül
Ndel Hindlll BsaAl | Clal\ I Swal
i I Ii
Sapl
EeoRl Bell
J_I
Bglll
1 1 1 '1 1 ¡p^^fetoüM 1 1 ORF-21 lOlori1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 repA (ORF-1)1 1 1 1 О 1ORF-3 "ORF-4 1 , 1
| 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 '
Рис. 2. Организация минирепликонов плазмид pBS72 (3081 п.н.) и pBS57 (2892 п.н.). Секвенированная последовательность содержит три полных (ORF 1-3) и одну неполную ("ORF 4") открытых рамки считывания. -.J - промотор, ■ -последовательность Шайн-Дальгарно, 6 - терминатор. Повторы: h - правая ориентация, С - левая ориентация. DnaA-связывающая последовательность - |.
Для этого были предприняты попытки клонировать и секвенировать минирепликоны природных плазмид, имеющих размер более 90 т.п.н. ДНК выделенных плазмид и вектор pMTL21C обрабатывали одной из рестриктаз, для которых в составе полилинкера имеются сайты рестрикции (Kp-nl, Smal, BamHl, Sall, Hindlll, Bglll, Xhol, EeoRl, Ps-tl, Sael, Styl), затем лигировали и полученной смесью трансформировали клетки B. subtilis. Этот прием обеспечивает возможность прямой селекции клеток B. subtilis, наследующих определенные рекомбинантные плазмиды. ДНК гибридных плазмид выделяли из клеток отобранных клонов и использовали для трансформации бактерии E. coli xl-1 Blu, из которых, в свою очередь, выделяли плазмидную ДНК для дальнейшего анализа.
В данной серии опытов с использованием рес-триктазы EcoRI удалось клонировать rep-область плазмиды pBS57 размером в 2.9 т.п.н. Установлено, что минирепликон этой плазмиды (далее обозначаемый как pMTLBS57) стабильно наследуется в клетках B. subtilis при выращивании в неселективных условиях в течение 20 генераций (стабильность наследования составляет 98%). Для выяснения молекулярно-генетической организации rep-области плазмиды pBS57 определили нук-леотидную последовательность клонированного репликона. Фрагменты размером 1.3 и 1.6 т.п.н., возникающие при совместной обработке плазмиды pMTLBS57 рестриктазами
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.