ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 1, с. 22-29
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577.151.32
ХАРАКТЕРИСТИКА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ИНВЕРТАЗЫ Saccharomyces cerevisiae В УСЛОВИЯХ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА suc2 В РАСТЕНИЯХ Solanum tuberosum
© 2014 г. А. Н. Дерябин, И. Н. Бердичевец, Е. А. Бураханова, Т. И. Трунова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276 Москва, Ботаническая ул., 35 E-mail: anderyabin@mail.ru Поступила в редакцию 25.01.2013 г.
Охарактеризованы некоторые свойства и активность внеклеточной инвертазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кодируемой геном suc2 в условиях гетерологичной экспрессии. Показано, что целевой ген suc2 активно экспрессируется в геноме трансформированных растений картофеля, а синтезируемый им белок инвертазы S. cerevisiae благодаря наличию сигнального пептида ингибитора протеиназы II транспортируется в апопласт и присутствует в этом компартменте в растворимой форме, слабо адсорбируясь на клеточной стенке.
DOI: 10.7868/S0002332914010056
Принципиально новые возможности для фундаментальной науки предоставляют трансформированные растения, которыми экспрессируются гены гетерологичных организмов, кодирующие белки с известными функциями. Применение трансформантов расширяет наши представления о роли продуктов отдельных генов в процессах роста и развития растений, а также в формировании ими устойчивости к стресс-факторам различной природы (Пирузян и др., 2000; Jewell et al, 2010). Нами на протяжении ряда лет изучается роль углеводного метаболизма в формировании конститутивной и индуцируемой пониженной температурой устойчивости холодостойких растений (в частности, картофеля) с привлечением трансформированных линий (Дерябин и др., 2003, 2007; Deryabin et al., 2005; Синькевич и др., 2008; 2009). В связи с этим особо интересна линия растений картофеля с измененным углеводным метаболизмом, вызванным интеграцией в геном целевого гена suc2, кодирующего внеклеточную инвертазу (P-D-фруктофуранозид фруктогидро-лаза, КФ 3.2.1.26) дрожжей Saccharomyces cerevisiae, под контролем промотора гена пататина класса I (В33-промотор). Поскольку пататин класса I — главный запасной белок в клубнях картофеля, то В33-промотор обеспечивает преимущественно клубнеспецифичную экспрессию контролируемого им гена suc2 (Mignery et al., 1988). На основе данных, свидетельствующих о том, что регуляция экспрессии генов происходит главным образом на уровне транскрипции, где регуляторной зоне (промотору) отводится ведущая роль, была исследована активность пататинового промотора в корне, стебле и листьях растений картофеля, вы-
ращенных in vitro. Полученные результаты подтвердили высокую тканеспецифичность В33-промотора и выявили его ограниченную активность в вегетативных органах (Дерябин и др., 2003; Наумкина и др., 2007).
Известно, что растительные инвертазы представлены несколькими формами, различающимися по локализации и биохимическим свойствам. Нейтральная или щелочная инвертаза имеет оптимум активности при pH 7—7.8 и представлена растворимыми белками, локализованными в цитоплазме, митохондриях и хлоропла-стах (Sturm, Tang, 1999; Murayama, Handa, 2007; Szarka et al., 2008; Vargas et al., 2008). Кислые инвертазы имеют оптимум активности при pH 4.5—5 и локализованы в виде растворимых белков в вакуоли и апопласте (Tymowska-Lalanne, Kreis, 1998; Sturm, Tang, 1999; Fotopoulos, 2005). Важно, что инвертазы, локализованные в апопласте, подразделяют на растворимые и нерастворимые, связанные с клеточной стенкой (Verhaest et al., 2005). Установлено, что инвертазы картофеля, локализованные в апопласте, ковалентно связаны с клеточной стенкой (Roitsch et al., 2003). Поэтому необходимо отметить уникальность для фундаментальных исследований линии картофеля с экспрессируемым геном suc2, заключающуюся в том, что интегрированный в растительный геном ген кодирует дрожжевую инвертазу с присоединенным к ее ^-концу сигнальным пептидом ингибитора протеиназы II картофеля, который обеспечивает апопластную локализацию чужеродной инвертазы (Sonnewald et al, 1997). Известно, что у высших растений апопластная инвертаза —
ключевой фермент углеводного метаболизма, задействованный в таких важных физиологических процессах, как разгрузка флоэмы, контроль дифференциации клеток и уровня сахарозы в свободном клеточном пространстве, транспорт сахарозы через плазмалемму и др. (Roitsch et al., 2003; Fotopoulos, 2005). Кроме того, у растений картофеля апопластная инвертаза координирует до-норно-акцепторные связи между главными фотосинтетическими (листья) и акцепторными органами — клубнями (Roitsch, Gonzalez, 2004).
Использование гена suc2 дрожжей S. cerevisiae в качестве целевого гена было обусловлено двумя причинами: инвертаза дрожжей чужеродна для картофеля, поэтому ее активность не подавляется растительными ингибиторами; по сравнению с растительными инвертазами дрожжевая инверта-за имеет более широкий диапазон рН (Von Schae-wen et al., 1990). Таким образом, линия растений картофеля со встроенным геном suc2 — удобный инструмент для изучения роли апопластной ин-вертазы и продуктов ее деятельности в процессе роста, развития и клубнеобразования. Интересы исследователей, работавших с этой линией, были направлены на изучение функциональной активности кодируемого геном suc2 белка инвертазы в условиях гетерологичной экспрессии и вызываемых им физиолого-биохимических изменений в метаболизме растений картофеля. У трансформантов по сравнению с контрольными растениями обнаружено увеличение общей активности кислых инвертаз, а также содержания сахаров (глюкозы и фруктозы) в клубнях (Frommer, Sonnewald, 1995) и листьях (глюкозы и сахарозы) (Дерябин и др., 2003). Трансформанты характеризовались пониженной чувствительностью к гипотермии (Дерябин и др., 2003; Deryabin et al., 2005), окислительному стрессу, вызванному паракватом (Синькевич и др., 2010), имели сниженный порог концентрации сахарозы, необходимой для инициации клубнеобразования in vitro (Аксенова и др., 2000). При этом они по сравнению с контрольными растениями формировали меньшее число клубней на одном растении, но большей массы (Sonnewald et al., 1997).
Однако не исключено, что при работе с трансформированными растениями трансген может прекратить экспрессироваться через какой-то промежуток времени. Поэтому для предотвращения возможной проблемы необходимо периодически контролировать наличие и экспрессию целевого гена. Для этого нами на протяжении нескольких лет проводились соответствующие исследования с использованием различных моле-кулярно-биохимических методов, что позволило выявить и охарактеризовать некоторые свойства и функциональные особенности внеклеточной инвертазы дрожжей S. cerevisiae, кодируемой геном suc2 в условиях гетерологичной экспрессии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований служили нетранс-формированные растения картофеля (Solanum tuberosum L., cv. Désirée) (далее WT-растения) и линия этого же сорта, трансформированная вектором, содержащим ген suc2, находящимся под контролем клубнеспецифичного пататинового промотора B33 класса I (далее В33-гот-растения). В экспрессионном векторе последовательность гена инвертазы дрожжей была слита с последовательностью лидерного пептида ингибитора про-теиназы II картофеля, обеспечивающей апо-пластную локализацию фермента (Von Schaewen et al, 1990). В33-ту-растения были получены с помощью агробактериальной трансформации (Rocha-Sosa et al., 1989), отобраны in vitro на питательной среде с канамицином и проверены на экспрессию трансгена методом Northern-блот-гибридизации (Rocha-Sosa et al., 1989; Sonnewald et al., 1997).
Растения размножали методом черенкования на стеблевые черенки с одной пазушной почкой и выращивали в пробирках, уплотненных ватно-марлевыми пробками, в камере Фитотрона ИФР РАН при 22°C и 16-часовом световом дне (освещенность 100 мкмоль квантов/(м2 • с), лампы OSRAM L 80W/640 (ОАО ОСРАМ, Смоленск, Россия) в течение 5 нед. Для размножения растений использовали питательную среду с минеральной основой по Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), дополненную 0.7%-ным агаром, 2% сахарозы, миоинозитом (60 мг/л), тиамином и пиридоксином (по 0.5 мг/л), рН 5.8. Материалом для исследований служили листья, взятые из средней части растений.
Суммарную ДНК выделяли методом, основанным на использовании цетилтриметиламмониу-ма бромида (Lipp et al., 1999). Присутствие в геноме В33-гот-растений целевого гена suc2 инвертазы дрожжей S. cerevisiae подтверждали полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Праймеры были подобраны с помощью программы Vector NTI на основе последовательности гена suc2 S. cerevisiae, представленной в базе данных NCBI (www.nc-bi.nlm.nih.gov): 5'-TCCAAGACAAAGATGCGT-TGCG-3' (прямой праймер (F)) и 3'-TGAAG-GAACCGCCAGCAGGT-5' (обратный праймер (R)). ПЦР проводили в амплификаторе MyCy-cler™ Thermal Cycler (Bio-Rad, США) при следующих условиях: предварительная денатурация при 94°C в течение 4 мин; затем 30 циклов, состоящих из стадий денатурации при 94°C в течение 45 с, отжига при 61°C в течение 1 мин, синтеза при 72°C в течение 1 мин; заключительная элонгация при 72°C в течение 5 мин. Реакционная смесь содержала: 50 мМ KCl; 20 мМ Tris-HCl (pH 9); 0.1% Triton Х-100; 2.5 мМ MgCl2; по 0.2 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 0.02 нМ каждого праймера; 150 нг геномной ДНК растений и 1 ед. акт. Taq-
полимеразы (Силекс, Россия). В качестве маркера длин нуклеотидных последовательностей использовали набор GeneRuler™ Express DNA Ladder (Fermentas, Литва). Амплифицированные фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в 1.5%-ном агарозном геле в Tris-ацетатном буфере, идентифицировали окрашиванием бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолете с помощью системы Gel Doc XR System (Bio-Rad).
Растворимые и связанные с клеточной стенкой фракции инвертазы выделяли методом Кришнана (Krishnan et al., 1985). Полученные фракции использовали для проведения электро-форетического разделения белков в полиакрила-мидном геле (ПААГ) без додецилсульфата-Na (Ds-Na) (нативный электрофорез) методом Дэви-са (Davis, 1964).
Активность кислой инвертазы в геле в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.