БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 577.113.6:577.212.2
© 1994 О. Н. Королева, Е. М. Волков, Т. С. Орецкая, 3, А. Шабарова
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ В ДВУСПИРАЛЬНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТАХ
XVI. СИНТЕЗ ДНК-ДУПЛЕКСОВ, СОДЕРЖАЩИХ РЕГУЛЯРНО ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ПОПЕРЕЧНЫЕ КОВАЛЕНТНЫЕ СШИВКИ
Химический факультет Московского государственного университета
им. М. В. Ломоносова
Ключевые слова: нуклеиновые кислоты; нуклеотиды, синтез.
Синтезированы два самокомплемеитарных декануклеотида общей структуры ТААТСС*АТТА (С* — остаток 5-метилцитидина, содержащего присоединенную по экзоциклической аминогруппе с помощью спейсера карбоксильную или аминофункцию). Конденсацией расположенных в разных цепях комплементарных комплексов карбоксильной и аминогруппы под действием водорастворимого карбодиимида с выходом около 20% получена ковалентная связь между декануклеотидами. Реакцией с глутаровым альдегидом с выходом до 20% осуществлена поперечная сшивка двух цепей в дуплексе, образованном самокомплементарным декануклеотидом упомянутой выше структуры, несущим алифатическую аминогруппу. Структура полученных «димеров» и положение места сшивки доказаны секвенированием по методу Макса-ма — Гилберта. Изучена поликонденсация под действием Т4-ДНК-лигазы модифицированных декануклеотидов, а также полученных продуктов сшивки. Показано, что феомент с неодинаковой эффективностью лигирует указанные соединения.
Многие жизненно важные процессы в клетке происходят с расплетанием двойной спирали ДНК. В частности, одна из ключевых стадий инициации транскрипции с промоторов Е. сой — это образование так называемого открытого промоториого комплекса с ферментом РНК-полимеразой, в котором цепи ДНК оказываются расплетенными [ 1] - С целью изучения механизма этого процесса, а также для разработки путей активного воздействия на него нами были предприняты работы по созданию модельных промотороподобных ДНК-дуплексов, содержащих поперечные ковалентные связи между двумя цепями. Несмотря на то что в литературе имеется достаточно большое количество работ по получению поперечно сшитых фрагментов ДНК (кросслинкингу), большинство из них посвящено созданию ковалентной связи между' концевым звеном одной из цепей и «внутренним» звеном (звеньями) другой [2—5], причем образующиеся продукты часто
Префикс d (дезокси) при обозначении олигодезоксирибонуклеотидов опущен. Использованные сокращения: ПААГ гголиакриламидпый гель; ФМЗ — фоефомоноэстераза; ФДЭ — фосфодиэсте-раза; MES — 2-морфолиноэтансульфонат.
весьма неоднородны. Описано лишь несколько способов получения строго специфических ковалентных сшивок между «внутренними» звеньями обеих цепей [ 6, 7], и практически отсутствуют данные о физико-химических и функциональных свойствах таких соединений.
В настоящем исследовании нами были опробованы два подхода к конструированию поперечно сшитых ДНК-дуплексов, содержащих ковалентные связи между олигонуклеотидами в строго заданных положениях двойной спирали. Первый из них предполагал образование амидной связи между находящимися в противоположных цепях амино- и карбоксильной группами, а второй — образование ковалентного «мостика» между двумя аминогруппами с помощью диаль-дегидов алифатического ряда, в результате чего получаются Шиффовы основания. Для реализации первого подхода нами была предложена модельная система, состоящая из двух самокомплементарных декануклеотидов общей структуры ТААТСС*АТТА, где С* — остаток 5-метилцитозина, к которому по эк-зоциклической аминогруппе с помощью епейсера в одном случае присоединена аминогруппа (10м), а в другом — карбоксильная (10е). При формировании между указанными декануклеотидами комплементарных комплексов карбоксильная и аминогруппы оказываются достаточно сближенными, и можно ожидать, что под действием конденсирующих агентов между двумя модифицированными основаниями будет образовываться ковалентная связь. Первичная структура декануклеотидов была выбрана таким образом, что при их полимеризации (под действием ДНК-лигазы) должен образовываться ДНК-подобный полимер (дуплекс I), содержащий повторяющуюся «идеальную» последовательность Прибноу (отмечена линией), участвующую в стадии «раскрывания» промотора [ 8].
. TAlATGC*ATTATAATGC*ATTATAATGC*ATTA. .. ...ATTAC*GTААТATTAC*GTAATATTAC*GTAAT... Дуплекс I
.. .С ATTATAATGC ATTATAATGC ATT ATA ATG...
...GTААТА7ТACGTААТATTACGTААТАТГАС... Дуплекс II
Ранее нами было показано, что ДНК-подобные полимеры той же структуры, но не содержащие модификаций (см. дуплекс II), способны in vitro формировать устойчивые двойные комплексы с РНК-полимеразой Е. coli, a in vivo в составе промотортестирующей плазмиды инициировать транскрипцию маркерного гена [ 9]. Поэтому получение и исследование свойств таких полимеров, содержащих сшивки, представляет интерес с точки зрения понимания механизма функционирования промоторов. В указанной структуре модифицированное звено (цитозин) не входит в состав функционально значимого структурного элемента промоторов (TATAAT) и предположительно не должно существенно влиять на узнавание этого участка ферментом, однако можно ожидать, что наличие поперечных связей должно препятствовать расплетанию цепей и образованшо прочного открытого комплекса. Для получения таких полимеров с регулярно повторяющимися сшивками мы использовали подход, включающий следующие этапы: синтез модифицированных олигонуклеотидов, реакцию между ними в составе комплементарных комплексов, энзиматическую полимеризацию.
Синтез целевых олигонуклеотидов проводили на автоматическом синтезаторе Applied Biosystems 360В стандартным амидофосфитным методом [ 10] На стадии присоединения модифицированного звена в реакцию вводили триазолидное производное тимидина. После завершения синтеза полимер с олигонуклеотидом делили на две части, одну из которых обрабатывали этилендиамином, а вторую — р-аминопропионовой кислотой по аналогии с методикой, приведенной в работе [11]. Отщепление олигонуклеотидов от полимерного носителя, удаление
Рис. 2
Рис. 1
К1 а К2 б 8 где К2 ж з и.
Рис. 1. Электрофорез в 20% ПААГ 5'-32Р-фосфорилировакных декануклеотидов: а — САТТАТААТО, б — р(Ю®4}, в — р(10с). ВРВ — положение красителя-маркера бромфенолового синего Рис. 2. Анализ методом Максама — Гилберта декануклеотидов, содержащих карбоксильную группу (а) и аминогруппу (б). Электрофорез в 20% ПААГ. Реакции расщепления: по Э — диметилсульфатом, по А — днэтилпирокарбонатом, по С — гидроксиламином, по Т — перманганатом калия Рис. 3. Радиоавтограф электрофоретического разделения в 20% ПААГ: продуктов конденсации под действием КДИ эквимолярных смесей (10к) и[32Р]р (10 с) (а), [32Р]р(10 и (10е) (б—е) после 72 ч инкубации при 0 (а, б) и 4° С (в—е) при рН 5,0 (в), 6,0 (а, б, г), 7,0 (5) и 9,0 (е). К^ и К2 — исходные декануклеотиды [з2Р]р(10С) и [32Р]р(10К); продуктов реакции [32Р]р(10М) (10~3 М) с глутаровым альдегидом (0,1 М) при 0 (ж, з) и 4° С (и) (время реакции 1 ч (ж) или 2 ч (з, и)) с последующей обработкой боргидридом натрия при 0° С в течение 2 ч. ХС — положение красителя-маркера ксиленцианола
защитных групп, анализ и выделение веществ проводили как описано в работе [12].
Некоторые характеристики полученных олигонуклеотидов подтверждают наличие в них модифицированного звена. В частности, электрофоретические подвижности олигонуклеотидов (10NI) и( 10е) отличаются от подвижности природного декануклеотида того же нуклеотидного состава (рис. 1), а время удерживания на колонке при анализе ион-парной ВЭЖХ карбоксилсодержащего соединения больше, чем аминосодержащего (16,55 и 14,04 мин соответственно), что согласуется с данными по анализу мононуклеотидов, содержащих аналогичные группы (см. «Экспериментальную часть»). При проведении исчерпывающего гидролиза смесью ФМЭ и ФДЭ змеиного яда с последующим анализом гидролизатов ВЭЖХ в специально подобранных условиях, обеспечивающих эффективное разделение нуклеозидов [12], в случае обоих декануклеотидов — (10к) и (10е) — отсутствовал пик, соответствующий элюции с колонки природного цитозинового нуклеозида, но появлялся пик с другим временем выхода. Для подтверждения первичной структуры продуктов (10N) и (10е) был использован метод Максама — Гилберта, при этом в стандартных условиях обработки химическими реагентами (см. рис. 2) [13] в обоих случаях не происходило заметной модификации (деструкции) неприродных гетероциклов (отсутствие соответствующей расщеплению полосы на радиоавтографе). На наличие нерасщепляемого звена указывает увеличение расстояния между сигналами, относящимися к предшествующему и следующему за модификацией звеньями. Оба радиоавтографа имеют идентичный вид в нижней части, где расположены продукты расщепления, не содержащие модифицированного звена, но различаются в «верхней» области, для которой характерно отличие в подвижностях фрагментов, несущих карбоксильную и аминогруппу. Соответствующие зоны ведут себя так же, как и исходные декануклеотиды: карбоксилсо-держащие соединения движутся быстрее, чем аминосодержащие.
Для реализации следующего этапа работы мы в первую очередь попытались провести реакцию конденсации между амино- и карбоксильной группами под действием водорастворимого карбодиимида в эквимолярной смеси декануклеотидов. Принимая во внимание обогащенность декануклеотидов, составляющих дуплекс, АТ-парами и литературные данные (полученные в аналогичных системах) о дестабилизирующем действии модифицированных оснований [11], реакцию проводили в условиях, наиболее благоприятствующих формированию двутяже-вых комплексов: при пониженной температуре (0° С) и относительно высокой концентрации олигонуклеотидов (10~4 М). Анализ реакционной смеси после 72 ч инкубации (время выхода реакции на плато) показал, что с выходом около 20% образуются продукты ковалентного соединения двух противоположных цепей с электрофоретической подвижностью, равной 20-звенному олигонуклеотиду (рис. За, б). Поскольку оба декануклеотида самокомплементарны, в растворе принципиально возможно образование трех типов комплексов: (10N): (10м), (10е): : (10N) и (10е): (10е). В работе Макмиллана и Вердина [11] было показано, что м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.