БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2003, том 29, № 6, с. 616-622
УДК 577.123.38:577.113.6
ХИМИЧЕСКИЙ И ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ а-ТИОТРИФОСФАТОВ НУКЛЕОЗИДОВ
© 2003 г. К. В. Антонов", Р. С. Есипов, А. И. Гуревич, Д. В. Чувиковский, Г. В. Микулинская, С. А. Феофанов, А. И. Мирошников
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 13.06.2002 г. Принята к печати 04.09.2002 г.
Предложены методы химического и химико-ферментативного синтеза 5'-тиофосфатов и 5'-а-тио-трифосфатов нуклеозидов. Полученные 5'-а-тиотрифосфаты были использованы в качестве субстратов для матричного ферментативного синтеза в ПЦР и в транскрипционной системе с Т7-РНК-полимеразой.
Ключевые слова: дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа фага Т5, иммобилизованный препарат, нуклеотиды, станниловые эфиры, фосфотиоатные аналоги.
ВВЕДЕНИЕ
Фосфотиоатные аналоги нуклеиновых кислот нашли широкое применение в молекулярной биологии. Интерес к таким аналогам РНК и ДНК обусловлен в первую очередь их устойчивостью к деградации под воздействием нуклеаз, что позволяет использовать их в качестве возможных эффективных терапевтических агентов.
Наиболее простым способом получения тиоа-налогов нуклеиновых кислот является матричный синтез с помощью РНК- и ДНК-полимераз, которые, как оказалось, способны использовать для этой цели в качестве субстратов 5р-диастере-омеры нуклеозид-а-тиотрифосфатов [1,2].
Разработка эффективного метода синтеза ри-бо- и 2'-дезоксирибонуклеозид-а-тиотрифосфатов, (с1)>>ГГР5, является, таким образом, важным условием для получения тиоаналогов нуклеиновых кислот в достаточном количестве для различных целей.
Существуют два подхода к химическому синтезу а-тиотрифосфатов нуклеозидов: непосредственное и избирательное тиофосфорилирование нуклеозидов фосфоротиотрихлоридом [3,4] и окисление серой соответствующих производных трехвалентного фосфора [5]. Первый путь, несомненно, более перспективен в технологическом смысле. Главный недостаток этого метода - невысокие (25-50%) вы-
Сокращения: (с1)ЖР5, (с1)ЫТРх - рибонуклеозид-
или 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-(Э-тиомоно-, а-тиоди- и а-тиотрифосфаты соответственно; КсР - ацетилфосфат; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ИФП - иммобилизованный ферментный препарат.
# Автор для переписки (тел.: (095) 330-72-47; эл. почта: kid@ibch.ru).
ходы целевых продуктов, что, по нашему мнению, связано с существенно пониженной по сравнению с хлорокисью фосфора реакционной способностью фосфоротиотрихлорида. Обойти это ограничение можно, повышая активность второй компоненты -нуклеозидного гидроксила, например, путем использования соответствующих алкоголятов, как это было сделано в работе [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе мы использовали для тио-фосфорилирования нуклеозидов хорошо разработанный метод активации гидроксильной группы через образование станниловых эфиров [7, 8]. Трибутилстанниловые эфиры углеводов обычно получают при кипячении последних в толуоле в присутствии бис(трибутилолово)оксида (Г). При этом сами эфиры, как вещества недостаточно стабильные, не выделяются и об их структуре судят по продуктам дальнейших реакций. Как правило, при взаимодействии полиолов с одним эквивалентом оксида (I) происходит этерификация первичных гидроксильных групп [7].
В качестве субстратов для тиофосфорилиро-вания мы выбрали аденозин и дезоксиаденозин. Кипячение дезоксиаденозина с эквивалентом оксида (I) в толуоле или диоксане приводит к его растворению. Смесь остается гомогенной и после охлаждения. ТСХ-контроль реакции после добавления фосфоротиотрихлорида показал быстрое исчезновение исходного нуклеозида (до которого разлагается станниловый эфир в условиях ТСХ) и образование одного продукта с большим значением Исследование реакционной смеси методом 31Р-ЯМР показало наличие, кроме сигнала
(фАёо + (Ви38п)20
(I)
N
Ви38пО—| 0
Я
ОН я
+ Ви^пОН
Рвеи
NH2
СЬРО
ОН И
+ ВизБпОРСЬ (III)
(Па): К = Н (Пб): Я = ОН
Е1, Е2. ЕЗ
ОН я
(1Уа): Я = Н (1Уб): Я = ОН
(Ви3М)4Н4Р207
V"
Ч
-0 0 он я
О 0 II -Р- 5
II -Р-0 11 -О-Р-
О" 1 О" 0"
он я
(Уа): Я = Н (Уб): Я = ОН
Схема 1. Синтез 5'-тиофосфата и 5'-а-тиотрифосфатов нуклеозидов и 2'-дезоксинуклеозидов.
исходного Р8С13 при 30.7 м.д., еще двух синглетов равной интенсивности при 45.3 и 56.8 м.д., принадлежащих, видимо, нуклеозиддихлортиофосфату (Па) и трибутилоловооксиддихлортиофосфату (III) (схема 1).
2'-Дезоксиаденозин-5'-тиофосфат (1Уа) был получен с выходом 80% после гидролиза реакци-
онной смеси раствором №2С03 и ионообменной хроматографии на ОЕАЕ-Тоуореаг1. Строение продукта (1Уа) подтверждено спектрами 13С- и 31Р-ЯМР (а также превращением в а-тиотрифос-фат (Уа) при ферментативном фосфорилирова-нии). В частности, тиофосфорилирование 5'-поло-жения остатка дезоксирибозы (региоселектив-
ность реакции) подтверждалось расщеплением сигналов С4' и С5' на атоме фосфора в спектре 13С-ЯМР.
Добавление к реакционной смеси избытка тет-ра(три-н-бутиламмоний)пирофосфата приводит, по данным ТСХ, к исчезновению промежуточного соединения (На) и образованию смеси с преобладанием вещества, близкого по подвижности к нуклеозидтрифосфатам. После гидролиза этот продукт был выделен ионообменной хроматографией и охарактеризован спектрами 31Р-ЯМР как целевой а-тиотрифосфат (Va) (эквимолярная смесь Rp- и 5р-диастереомеров). Следует отметить, что высокие выходы соединения (Va) (60-70%) достигались только при использовании свежеприготовленного раствора тетра(три-я-бутиламмоний)пирофосфата в DMF или при получении его in situ из тетрапиридиниевой соли пи-рофосфата и три-н-бутиламина. В первом случае продукт реакции выделяется из раствора в виде эмульсии, во втором, имела место гетерофазная реакция, скорость которой не зависела от применяемого растворителя (толуол или диоксан).
Аналогичным образом, из аденозина был получен аденозин-5'-0-(а-тио-трифосфат) (V6) с общим выходом 70%. Следует отметить, что взаимодействие аденозина с оловооксидом (I) происходит только при добавлении к смеси значительного (10-20%) количества полярного апротонного растворителя (DMF или триметилфосфата), что, по-видимому, связано с меньшей растворимостью станнилового эфира рибонуклеозида.
Мы изучали также поведение в реакциях стан-нилирования-тиофосфорилирования некоторых производных аденозина, а именно: 2'- и З'-моно- и 2',3-ди-О-бензоиладенозинов (здесь не описано). Реакция с PSC13 идет только в случае 2'-бензоила-денозина. После добавления тетра(три-н-бути-ламмоний)пирофосфата, исчерпывающего гидролиза водным аммиаком был получен тиотри-фосфат (V6), однако, со значительно меньшим общим выходом.
Предложенным нами вариантом метода тио-фосфорилирования были синтезированы также 5'-а-тиотрифосфаты тимидина, дезоксигуанози-на и уридина. Эти результаты будут опубликованы отдельно.
Альтернативный путь получения (d)NTPs из (d)NMPs основан на использовании ферментативного фосфорилирования. Его главное преимущество - стереоспецифический характер ферментативного процесса, приводящего только к одному диастереомеру (S).
Для фосфорилирования dAMP5 (IVa) мы использовали иммобилизованные ферментные препараты (ИФП), полученные на основе экстрактов контрольных клеток Е. coli (контрольный ИФП) и клеток Е. coli, трансформированных плазмидой,
содержащей ген дезоксинуклеозидмонофосфат-киназы (dNMP-киназы, КФ 2.7.4.13) бактериофага Т5. Известно, что фаговый фермент, в отличие от бактериальных dNMP-киназ, обладает широкой субстратной специфичностью [9]. Процесс, по нашему мнению, протекает по следующей схеме:
dAMP5 + ATP ^ dADPs + ADP
dADP5 + ATP ^ dATPs + ADP
2ADP + 2AcP2ATP + 2AcQ~ dAMP5 + 2AcP -—► dATP5 + 2 AcO"
Здесь El - dNMP-киназа E. coli или фага T5, Е2 и ЕЗ - бактериальные нуклеозиддифосфаткиназа (КФ 2.7.4.6) и ацетаткиназа (КФ 2.7.2.1) соответственно. Последняя, при добавлении в реакционную смесь донора макроэргического фосфата -ацетилфосфата - регенерирует АТР, что позволяет в 50—100 раз снизить расход АТР и упрощает выделение dATPs из реакционной смеси (нет необходимости отделять продукт от большого количества АТР).
Показано, что ИФП с dNMP-киназой бактериофага Т5 фосфорилирует dAMPs, хотя и с меньшей скоростью, чем dAMP: степень превращения тиоаналога нуклеотида в тиотрифосфат в выбранных условиях составила примерно 5% за первые 2 ч и около 50% за сутки. В случае контрольного ИФП с бактериальными ферментами Е. coli синтеза тиотрифосфата не наблюдалось
Таким образом, химико-ферментативный синтез в нашей системе с ИФП менее продуктивен по сравнению с химическим методом.
Полученные нами а-тиотрифосфаты нуклео-зидов были использованы для матричного ферментативного синтеза в ПЦР с 7ад-ДНК-полиме-разой на матрице гена проинсулина с праймерами А и В [10] и dATPs + dNTP в качестве субстратов (схема 2а). Поскольку скорость включения Taq-ЦН К- пол и м е раз о й dNTPs в цепь ДНК в 20 раз ниже, чем dNTP [11], то для повышения эффективности мы увеличили длительность стадии элонгации до 90 с, а число циклов амплификации до 35. Результаты разделения продуктов амплификации в 2% агарозном геле показаны на рис. 1.
АТР5 + NTP в качестве субстратов использовали для ферментативного синтеза РНК (схема 26) в транскрипционной системе с Т7-РНК-полимера-зой на матрице гена проинсулина, клонированного в плазмиде pET-20b(+) (Novogen). Образование транскриптов иллюстрируют данные электрофореза в 2% агарозном геле (рис. 2). Количество мРНК в образцах оценивали по результатам гибридизации с 32Р-меченым радиоактивным зондом Z (схема 26). При этом в образцах с АТР5 + 3NTP оно
А
(5') AATTCCATATGAAATTTGTTAACCAACACCTGT
(5')CGTCGCTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGTTCTCACCTGGTTGAAGCTCTGTACCTGGTTTGCGGT GAACGTGGTTTCTTCTACACCCCGAAGACTCGTCGTGMGCTGAAGACCTGCGGTTGGTCAGGTTGAACTGGGATGGTG GTCCGGGTGCTGGTAGCCTGCAACCGCTGGCTACCCACCACCACTGGAAGGTTCTCTGCAGAAGCGTGGTATCGTTGAA CAGTGCTGCACCTCTATCTGCTCTCTGTACCAGCTGGAGAACTATTGCAACTAAGCTT (3')
(3')TTGATAACGTTGATTCGAAGACA
В
(б)
CATGGTCGACCTCTTGATAAC (5') (5') .. UUGAACAGUGCUGCACCUCUAUCUGCUCUCUGUACCAGCUGGAGAACUAUUGCAACU
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.