БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 354 - 358
УДК 577.113.4:577.112.5
ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ГЕНА ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ (ЭГЛИН С) БЕЗ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Т4-ДНК-ЛИГАЗЫ И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В Е. coli
© 1995 г. В. II. Вейко, А. С. Осипов, И. И. Шехтер, М. Г. Буленков, К. И. Ратманова, Л. Б. Гулько, Н. А, Чибискова, Л. Л. Эррайс, Е. Б. Деревщикова, В. Г. Дебабов
Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
Поступила в редакцию 21.12.94 г.
Синтетический ген ингибитора протеиназ (эглин С), полученный прямой амплификацией из олиго-нуклеотидов бет использования ДНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4, клонирован в экс-прессионных векторах. Целевой полипептид выделен в гомогенном состоянии. Достигнут высокий уровень продукции (110- 130 мг/л) полипептида в штаммах Е. соП.
Ключевые слова: эглин С, амплификация, экспрессия, Escherichia coli.
Эглины В и С (70-звенные полипептиды, различающиеся только одной аминокислотной заменой Н35У) - белковые ингибиторы протеиназ, выделенные из пиявок Шгш1о тесИс1паИх \! ], Они эффективно ингибируют а-химотрипсин, химазу, субтилизин, протеиназы нейтрофилов (э ласта за и катепсин О). По своим ингибиругощим свой-
ствам эглин С, аминокислотная последовательность которого приведена ниже [2], аналогичен эндогенным ингибиторам протеиназ человека -$2-макроглобулнну и «1-антитрипсину, служащим в норме для защиты нижних дыхательных путей от протеолитического действия эластазы из нейтрофилов [3].
1 10 20 30 40 50 60
TEFGSELKSFPEVVGKTVDQAREYFTLHYPQYHVYFLPEGSPVTLDLRYNRVRVFYNPGT
70
NVVNHVPHVG
Эглин С
В случае нарушения баланса эластазы и эндогенных ингибиторов, что может быть обусловлено генетически, развиваются воспалительные процессы в тканях легких, а также в печени, суставах, поджелудочной железе [4]. В экспериментах на животных с модельной эмфиземой или общим сепсисом показано, что эглин С является эффективным терапевтическим средством [5, 6]. Показано также, что рекомбинантный и аутентичный эглины С имеют идентичные физико-хи-мические и биологические свойства [7].
Кроме того, эглин С, несмотря на отсутствие дисульфидных связей внутри молекулы, высокоустойчив к термо- и кислотной денатурации [8]. Это свойство эглина С, а также установленная на
Символ "<Г в формулах дезоксирибоолигонуклеотидов опущен.
Адрес для переписки: 113545, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1, Вейко В.П.
основе рентгеноструктурного анализа третичная структура полипептида [9] позволяют использовать его в качестве модельной системы при проведении работ в белковой инженерии: мы предполагаем клонирование фрагментов структурной части гена а2-интерферона человека в составе гена эглина С. При этом достаточно устойчивая третичная структура эглина (как белка-носителя) должна обеспечить конформационное подобие дативному состоянию введенного фрагмента интерферона. Изучение свойств химерных белков может способствовать выяснению структурно-функциональных отношений в интерферонах.
В настоящей работе мы сообщаем о химическом синтезе гена ингибитора протеиназ (эглин С) и его экспрессии в Е. coli.
Общая схема синтеза гена эглина С представлена на рис. 1, а структуры используемых синтетических олпгонуклеотидов приведены ниже.
ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ГЕНА ИНГИБИТОРА ПРОТЕИН A3
355
Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе
1. ТATGAATTCGAACAGGAGACTTTCTGATGACTGAATTTGGTTCTGAGCTGAAATC-TTTCCCGGAAG
2. TTGTTGGTAAAACTGTTGACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCACTACCCGCA-GT ACGACGTTTAC
3. TTCCTGCCGGAGGGTTCCCCGGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTG-TT ТТСТАСААС
4. CCAGGTACTAACGTAGTTAACCATGTACCGCACGTTGGTTAG
5. AACAGTTTTACCAACAACTTCCGGGAAAGATTTCA
6. CCCTCCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGC
7. CTACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAACACG
8. TTTTGG ATCCCT AACC AACGTGCGGTAC
9. T TTTGGATCCAT GACT GAATTTGGTTCTGAGCTGAAAT CTTTCCCGGAAG
10. ТТТТТТС'СААСТААССААССТОСОС
11. ТТТТСАССТССТ ОС АС А АТС А АС
12. ТТ ТТСОАТСССТССТСТСТСААТС
Первым этапом работы являлся синтез гена эглина С, содержащего фланкирующие части, введение которых позволяло проводить конструирование целевых экспрессионных плазмид, несущих ген полипептида.
Б . :Итературе описаны варианты сборки синтетических структур ДНК либо "классическим" ли-гированием с применением Т4-ДНК-лигазы, либо с помощью амплификации предварительно обработанного лигазой дуплекса [10]. Оба варианта предполагают фосфорилирование соответствующих олнгонуклеотидов Т4-полинуклеотидкина-зоп. В данной работе, аналогично работе [11], мы отказались от использования этих двух ферментов прп сборке гена эглина С (рис. 1) и получали дуплексы ДНК прямой амплификацией смеси синтетических олигонуклеотидов.
В результате проведенных экспериментов было показано, что наиболее эффективно сборка дуплекса осуществляется при концентрациях до
- 10" М каждого из олигонуклеотидов. При более высоких концентрациях праймеров выход целевых дуплексов резко уменьшался (рис. 2).
Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК I (олигонуклеотиды (1) - (8)) расщепляли соответствующими рестриктазами (рис. 1) и клонировали в составе мультикопийного экспрес-сионного вектора рРК-ТОАТС;-1 [12]. Для клонирования фрагмента П в качестве мультикопийных векторов использовали плазмиды риС18 и рГ1С19, в составе которых нами был дополнительно
клонирован промотор гена уридинфосфорилазы (Pudp, 169 п. о.) из Е. coli, полученный амплификацией с плазмиды pUD7 [13] (олигонуклеотиды (11), (12)). При амплификации регуляторный элемент был искусственно фланкирован сайтами рестрик-таз SacI и ВатШ. Производные плазмид pUC18 и pUC 19 назвали pUU18 и pUU19 (рис. 1).
Таким образом, были получены три варианта экспрессионных векторов (pTEG, pUEG18 и р UEG19), структуры которых приведены на рис. 1. Отбор рекомбинантных клонов после проведения трансформации Е. coli проводили в случае pTEG гибридизационным скринингом in situ с использованием биотинилированного [14] олиго-нуклеотида (7), а при поиске целевых клонов, содержащих плазмиды pUEG18 и pUEG19, - прямой амплификацией ДНК клонов с использованием "универсального" (GTAAAACGACGGCCAGT) и "реверсивного" (CAGGAAACAGCTATGAC) синтетических праймеров. Соответствие полученных конструкций запланированным вариантам подтверждали определением первичной последовательности плазмид, выделенных из целевых клонов.
Среди штаммов-продуцентов, полученных трансформацией TGI, С600 и XL1 сконструированными экспрессионными плазмидами, наибольший уровень накопления эглина С наблюдался в штаммах С600 и XL1 Blue (см. таблицу); он достигал не менее 12-14 мг/г сырой биомассы (110- 130 мг/л ферментационной культуры).
356
ВЕЙКО и др.
ЕсоШ
2__ _3_
эглин С
ВатШ
_L
i
км
cits 857
orí
EcoR\
A
амплификация
RM
cits 857
ВатШ
2 3
эглин С
Hindi И _i_
II
ВатШ
nlJU18 (pUUI9) ]|ApR
Sad
1'ис. 1. Общая схема получения гена эглина С и конструирования экспрессионных векторов. 1 - 10 - номера олигонук-леотидов (см. текст), Pudp - промотор уридинфосфорилазы из К. coli.
Выделение эглина С проводили (после разрушения биомассы ультразвуком) в два этана. На первом этапе осаждали балластные белки Е. coli смесью этилового спирта с водой (10 : 1), эглин С оставался в растворе. На втором этапе, после концентрирования супернатанта, эглин С очищали гель-фильтрацией на носителе HW-55 (Тоуо-
Биосинтез эглина С в Е. coli
Штамм-продуцент Накопление эглина С, мг/г сырой биомассы
С600 (pTEG) 14
С600 (pUEG 18) 10
С600 (pUEG 19) 11
TGI (pTEG) 9
TGI (pUEG18) 9
TGI (pUEG 19) 10
XL1 (pTEG) 14
XL 1 (pUEGIS) 12
XL! (pUEGI9) 14
Soda, Япония). В качестве элюента использовали 10 мМ раствор уксусной кислоты в воде. Результаты анализа гомогенности выделенного препарата приведены на рис. 3. Исследование ингиби-рующей активности выделенного полипептида по отношению к а-химотрипсину и эластазе показали его полную идентичность с образцами ре-комбинантного эглина С фирмы "Sigma".
Полученный штамм-продуцент высокоэффективного ингибитора протеиназ (эглина С) может быть использован для получения препарата, имеющего терапевтический эффект как при локальном, так и при общем воспалительном процессе (например, пневмония, эмфизема или общий сепсис).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали ДНК-лигазу и поли-иуклеотидкиназу фага Т4, набор белков-сгандар-тов для электрофореза (Pharmacia, Швеция), эн-донуклеазы рестрикции фирмы Amersham (Англия), наборы "Амплификация" и "Сиквенс И"
VPstl
ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ГЕНА ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ
;кДа
94.0 67.0
43.0 30.0
357
7
1
!I
20.1 í
14.4
Рис. 2. Электрофоретический анализ продуктов амплификации олигонуклеотидов (фрагмент I, см. рис. 1) в 1.5% агарозном геле. Молярная концентрация каждого из олигонуклеотидов в реакционных смесях:
Ю-8 (2), 5 х
1 х 10"8 (/), 3 х 2.5 х КГ7 (5), 5 х 1(Г7 (б).
1(ГЛ (J), 1 х 10"' (4),
производства НПО "Ферментас" (Литва). Определение первичной последовательности ДНК проводили по Сэнгеру [15] согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Трис, акриламид, N.N'-мети ленбисакри ламил. агароза, SDS, EDTA, кумасси R-250, а-химотрипсии, эластаза, неорганические соли - препараты производства Sigma (США), 2-меркаптоэтанол - Ftuka (Швейцария).
Химический синтез и выделение олигонуклеотидов осуществляли по ранее описанной методике [14].
Оптимизацию конструкций синтетических олигонуклеотидов проводили с использованием пакета программ "DNA-sun", разработанного в секторе математического моделирования (ВНИИгенетика).
В работе использовали следующие штаммы E.coli. TGI {SupE, hsdAS, thi, A(lac-proAB), F[traD16,proA+B+, lacV, /acZAM15J); C600 (F", thi-1, thr-1, leithG, IctcYX, tonA2\, supEM, Ar); XL1 Blue
(Ree A1, end A1, gyrA96, thi, hsdR 17{rk } , supEM, relA 1, At [FproAl, lacl\ !acZAM\5, Tnl0(tetr)J.
Рис. 3. Электрофоретическое разделение белков клеточных лизатов штамма-продуцента эглина С С600 (pTEG) до термоиндукции (2, 3) и после термоиидук-ции (4); 1,5-маркеры; 6-рекомбинантный эглин С (Sigma, США); 7- выделенный рекомбинантный эглин С.
Приготовление компетентных клеток Е. coli, трансформацию, клонирование, выделение плаз-мидной ДНК проводили так, как опи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.