БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 359 - 364
УДК 577,213:577 113.6
ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ, КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА АНАЛОГА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНАФИЛАТОКСИНА С5а
© 1995 г. И. Н. Бабкина, С. В. Серегин, Н. К. Да ми люк, А. Н. Синяков,
С. Е. Гладкова, С. Г, Поздняков
Научно-исыедователъамй институт молекулярной биологии, II ПО "Вектор", пос. Кольцова Новосибирской обл., 633159 Поступила в редакцию 29.03.94 г. После доработки 25.11.94 г.
Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование гена аналога человеческого анафилатоксина С5а. Получена рекомбинантная плазмида pRC5a, обеспечивающая в клетках Е. coli экспрессию синтетического гена. Биологическая активность продукта экспрессии искусственного гена доказана тестированием хемотакси ческой активности и выхода миелопероксидаз из перитонеаль-ных клеток крысы под воздействием лизатов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантный белок.
Ключевые слова. система комплемента: анафилатоксин С5а; ген аналога человеческого анафила-токсина С5а, химико-ферментативный синтез; клонирование; экспрессия.
Одним из белков системы комплемента, играющих важную роль в регуляции иммунного ответа и воспалительном процессе, является анафилатоксин С5а. В отличие от другого, наиболее изученного анафилатоксина СЗа, который обладает иммуносупрессорными свойствами. С5а усиливает иммунный ответ организма. Активация системы комплемента классическим либо альтернативным путем приводит к различному количественному соотношению в организме между вышеназванными белками, что и определяет развитие иммунологических реакций при аутоиммунных заболеваниях шш защите от бактериальных инфекций [1].
Участие СЗа в процессе воспаления опосредовано медиаторами, секретируемыми различными клетками крови. К медиаторам относятся гиста-мии, выделяюппгася■ из тучных клеток, а также серотонин, лизосомные ферменты (миелоперок-сядазы), лейкотриены и простаглапдины, секре-тнруемые полиморфно-ядерными лейкоцитами и моноцитами. Анафилатоксин С5а вызывает направленное движение этих клеток (хемотаксис), которые обладают в свою очередь предпочтительной адгезией к эндотелию сосудистой стенки [2]. Таким образом возникает локальное увеличение проницаемости сосудистой стенки, отек ткани, накопление клеток крови в просвете сосуда, т.е. картина, присущая воспалительной реакции.
Высокая биологическая активность анафилатоксина С5а в процессе активации системы комплемента привлекает к нему в последнее десятилетие пристальное внимание исследователей, работающих в области иммунохимии, молекулярной
биологии и иммунопатологии, а также представляет несомненный интерес для практической медицины.
Ввиду того что донорская кровь человека является весьма ограниченным источником анафилатоксина С5а, а также учитывая трудоемкость методов выделения и очистки природного белка [3, 4], наиболее перспективным представляется генно-инженерный способ его получения.
С этой целью нами осуществлен химико-ферментативный синтез гена аналога человеческого анафилатоксина С5а. Целевая последовательность гена С5а была произвольно разделена на три фрагмента, кодирующие аминокислотные последовательности 1 - 37 (I), 38 - 62 (II) и 63 - 74 (III) аналога С5а. 5'-Концевая часть гена ограничена сайтом рестрикции ВатШ, а 3'-концевая - кодо-ном терминации трансляции и сайтами ВатШ и Sa/Gl (рис. 1). Искусственный ген кодирует белок, который отличается от природного С5а [5] лишь двумя аминокислотными заменами: Met вместо Thr в положении 1 и Ser вместо Cys в положении 27 (рис. 1). По данным Моллисона с соавт. [6J, эти замены не изменяют специфическую активность белка С5а. Первая замена произведена для обеспечения прямой экспрессии гена в клетках Е. coli, вторая - исходя из особенностей структурно-функциональной организации молекулы: три внутримолекулярные дисульфидные связи образованы шестью остатками Cys, тогда как аминокислотный остаток Cys в положении 27 единственный, несущий свободную SH-группу. Это при экспрессии в гетерологичной системе может приводить к
(Т) 14
ВатШ MLQKK 1 ЕЕ I AAKYK
GATCCAGT ATG TTG CAA AAA AAA ATT GAA GAA ATT GCT GCT AAA TAT AAA
(С) 30
HS VVKKC CYDGASVN N
CAT TCT GTT GTT AAA AAA TGT TGT TAT GAT GGA GCT TCT GTT AAT AAT
46
DETC E Q R * A A R I S L G P R GAT GAA ACC TGC GAA CAA CGC GCT GCT AGA ATT TCT TTG GGA CCT AGA
62
CI KA F TECCVVA SQL R* TGT ATT AAA GCA TTT АСА GAA TGT TGT GTT GTT GCT TCT CAA TTG AGA
74
AN I S HKDMQLGR Stop ВатШ GCG AAT ATT TCT CAT AAA GAT ATG CAA TTG GGA AGA TAG GATCCGTCGA
Sal G!
Рис. i. Нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности синтетического гена аналога человеческого анафилатоксина С5а. В скобках над символами аминокислот указаны аминокислоты в природном белке С5а; звездочками отмечено разбиение гена на три фрагмента (пояснения в тексте).
образованию "неправильных" дисульфидных внутри- и межмолекулярных связей.
Общая схема конструирования рекомбинант-ной плазмиды pFHC5a/3, содержащей ген аналога человеческого анафилатоксина С5а, приведена на рис. 2. Дуплекс (фрагмент I), полученный ли-гированием шести олигонуклеотидов ((1) - (6)), клонировали в векторной плазмиде pFH123, аналогично клонировали фрагмент II, полученный в результате достройки ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) двух частично комплементарных полинуклеотидов (7) и (8), после чего целевые фрагменты выделяли из рекомбинантных плаз-мид (см. рис. 2, табл. 1 и "Экспериментальную часть ') и клонировали совместно с олигонуклео-тидным дуплексом ((9) и (10)), составляющим фрагмент III, в той же векторной плазмиде.
Для достижения экспрессии гена аналога С5а была сконструирована рекомбинантная плаз-мида pRC5a, содержащая синтетический ген под контролем recA-промотора Proteus mirabilis. Для этого на первой стадии получали плазмиду pFHC5ad, в которой был смещен участок узнавания для ре-стриктазы Fokl относительно ?'-конца гена (клонировали /^й-Зя/ОТ-фрагмент гена из плазмиды pFHC5a/3 в векторе pFH123/£c<?RI-Sa/GI совместно с олигонуклеотидным дуплексом в качестве коннектора; см. рис. 3). На второй стадии была использована полученная нами ранее экспресси-рующая ген человеческого интерлейкина-2 (IL-2) плазмида pRIL3 [7], в которой ген IL-2 был заменен геном С5а из плазмиды pFHCiad. Строение целевой рекомбинантной плазмиды pRC5a показано на рис. 4.
Таблица 1. Синтетические олигонуклеотиды, использованные для сборки гена аналога человеческого анафилатоксина С5а
Номер Структура (51 - 3') Кодируемая область (а/к)* Длина цепи
1 GATCCAGT ATGTTGCAAAAAAAAATTGAAGAAATTGCTGCTAAAT АТАААСАТ-TCTGTTGTTAAAAAATG 1-21 (+) 70
2 TTGTTATGATGGAGCTTCTGTTAATAAT 22 - 30 (+) 28
3 GATGAAACCTGCGAACAACGCGC 31 -37 (+) 23
4 TTTATATTTAGCAGCAATTTCrrCAATTTTTTTTTGCAACATACTG 1 - 14 H 46
5 TCCATCATAACAACATTTTTTAACAACAGAATG 15-25 (-) 33
6 GATCGCGCGTTGTTCGCAGGrrTCATCATTATTAACAGAAGC 26 - 37 (-) 42
7 CGCTGCTAGAATTTCTTTGGGACCTAGATGTATTAAAGCATTTACAGAA 38 - 53 (+) 49
8 CCTGTCGACGCTCTCAATTGAGAAGCAACAACACAACATrCTGTAAATGCTTTA 49 - 63 (-) 54
9 AGCGAATATTTCTCATAAAGATATGCAATTGGGAAGATAGGATCCG 63 - 74 (+) 46
10 TC'GACGGATCCTATCTTCCCAATTGCATATCTTTATGAGAAATATT 64 - 74 (-) 46
* а/к - аминокислоты аналога С5а, (+) - кодирующая цепь, (-) - комплементарная ей.
ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ
361
Eco R1
клонирование в pFH123/£cy;RI~Sü/GI EcoR\
Рис. 2. Общая схема конструирования рекомбинантной плазмиды pFHC5a/3, содержащей ген аналога человеческого анафилатоксина С5а.
М L Q С5а С A G Г А Т G'T Т О'С А А ............ ■ ......—-—,_
TACAACGTT-------1
SalGl
{Fok\-SalG\ фрагмент плазмиды pFHC5u/3)
+ £c6>RI-Füí:l-40HHeKT0p
(51) AATTCTGGATG
GACCTACGTCA (5') клонирование в векторе pFH123/&YjRI~WGr
Fokl
М
L
С5а
•AATTCTGGATGCAG ТА Т G'T Т^'С А А
G А С С Т А С G Т С А Т А С А А С G Т Т
SalGl
Рис. 3. Схема смещения участка узнавания для рсстриктазы Рок! относительно 5'-конца гена С5а и строение района, прилегающего к 5'-концу гена С^а в плазмиде рРНС5ас1. Штриховой линей обозначено место расщепления рестрикта-зой Рок\.
Рис. 4. Рекомбинантная плазмида pRC5a, экспресси-рующая ген аналога анафилатоксина С5а под контролем индуцибельного промотора белка recA Proleus mirabilis (выделен штриховкой).
(а) (б)
/ щ
2
3
4
Рис. 5. Оценка уровня экспрессии рекомбинантного белка С5а методом радиоиммунного анализа. Радиоавтограф дот-блоттинга: а - лизаты клеток Е. coli VLI222 (pRCSa), по Юмкл наточку (сконцентрированы в ¡00 раз): / - в момент внесения индуктора мито-мицина С, 2-4-6, 12 и 18ч индукции соответственно; б - человеческий С5а, выделенный из плазмы доноров: /-0.25, 2-0.5, J - I мкг.
Штаммы-продуценты рекомбинантного белка аналога С5а получали путем трансформации плаз-мидой pRC5a бактериальных штаммов Е. coli JMI03 и VL1222 (последний обладает пониженной способностью к внутриклеточному протео-лизу). Условия культивирования бактериальных клеток и индукции синтеза рекомбинантного белка были аналогичны описанным ранее [7]. Для оптимизации этих условий и сравнения уровней синтеза использовали дот-блоттинг. Для этого
клеточные лизаты наносили на нитроцеллюлозу в виде зон диаметром 2 - 3 мм. Образцы, содержащие белок С5а, выявляли полученной нами козьей поликлональной сывороткой к человеческому анафилатоксину С5а, выделенному из плазмы доноров, как описано ниже (рис. 5). Максимальный уровень экспрессии рекомбинантного белка достигался через 6 - 12 ч после внесения индуктора в ростовую среду и составлял около 1 мкг/мл бактериальной культуры, что соответствует не более 0.5% от суммарного клеточного белка, причем, как видно из рис. 5. дальнейшее увеличение времени культивирования приводило к существенному (в 4 - 5 раз) уменьшению количества тестируемого белка. Уровень экспрессии в клетках использованных нами штаммов Е. coli практически одинаков.
Тот факт, что продолжительное культивирование существенно снижает количество тестируемого рекомбинантного белка С5а даже в случае использования штаммов Е. coli с пониженной протеолитической активностью, ранее был также отмечен Мандеки с соавт. [8]. Видимо, скорость протеолитической деградации не являе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.