научная статья по теме «ХИТИН-СПЕЦИФИЧНЫЕ» ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТЕНИЯХ Химия

Текст научной статьи на тему ««ХИТИН-СПЕЦИФИЧНЫЕ» ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТЕНИЯХ»

БИОХИМИЯ, 2ÜÜ3, том 6S, вып. 1, с. 133 - 13S

УДК 577.152.1

«ХИТИН-СПЕЦИФИЧНЫЕ» ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТЕНИЯХ

© 2003 г. И.В. Максимов*, Е.А. Черепанова, Р.М. Хайруллин

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, пр. Октября, 69; факс: (3472)356100, электронная почта: phyto@anrb.ru

Поступила в редакцию 17.12.01 После доработки 05.02.02

Изучали способность пероксидазы из проростков различных видов растений связываться с хитином. В присутствии хитина происходит повышение пероксидазной активности в растительном экстракте, причем у одних видов активируются пероксидазы во фракции, не сорбирующейся на хитин, а у других — во фракции, связывающейся с ним. Показано, что у овса посевного (Avena sativa), риса культурного (Orysa satira), хрена деревенского (Armoracia rusticana), редиса посевного (Raphanus sativus var. radicha), арахиса подземного (Arachis hypogaea), табака (Nicotiana tabacum) с хитином связываются анионные изопероксидазы. У гороха посевного (Pisum sativum), козлятника восточного (Galega orientalis), огурца посевного (Cucumis sativus), цу-кини (Cucurbitapepo L.) кроме анионных изопероксидаз сорбируются и катионные. Сравнивается активация пероксидаз под влиянием хитина с процессами, происходящими при сверхчувствительной реакции и лиг-нификации точек проникновения гриба при патогенезе. Высказываются предположения о роли «хитин-специфичных» изопероксидаз в ингибировании роста фитопатогенных грибов и о связи этого явления со структурными особенностями отдельных изопероксидаз.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пероксидаза, изоформы, хитин, активация, сорбция.

При патогенезе в растениях происходит увеличение уровня лигнина, являющегося наиболее эффективным защитным барьером на пути проникновения фитопатогенов [1—4]. Это подтверждается скоплением лигниноподобного материала в точках проникновения гриба в растительную клетку [3—5]. Механизм этого явления не известен, но можно предположить, что на поверхности клеточных стенок фитопатогена имеются соединения, способные привлекать растительные ферменты, участвующие в биосинтезе лигнина. Такими соединениями, содержащимися в значительных количествах в клеточных стенках патогенных грибов, могут быть хитин и (или) глюканы [6].

К растительным белкам, непосредственно взаимодействующим с хитином, относятся лек-тины и хитиназы [7—9], которые, однако, не участвуют в реакциях, связанных с формированием лигнина. Ферментом, быстро отвечающим на действие различных стрессоров и активно включающимся в процессы лигнификации, является пероксидаза [10, 11]. Активность пероксидазы многократно повышается в тканях растений,

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

инфицированных фитопатогенами [12—14]. В особенности такое свойство характерно для форм изопероксидаз, связанных с клеточной стенкой [2, 5]. В литературе приводятся сведения о способности пероксидазы эффективно включаться в процессы межмолекулярного сшивания различных компонентов клеточной стенки растений, таких как целлюлоза, каллоза, ксиланы, пектины [15—17]. Однако широкая субстратная специфичность пероксидазы и множественность ее изоформ затрудняют определение роли этого фермента в развитии растений и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.

Ранее у анионных пероксидаз пшеницы нами было выявлено свойство связываться с хитином и клетками возбудителя твердой головни пшеницы Tilletia caries Tull. [18]. Однако, насколько оно характерно для пероксидаз из других видов растений, оставалось неизвестным. Поэтому задачей представленной работы является поиск у разных видов растений изопероксидаз, способных взаимодействовать с хитином. Решение этой задачи, на наш взгляд, позволило бы приблизиться к пониманию механизмов формирования защитных свойств растений против проникновения фитопатогенных грибов.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований служили 4-дневные проростки овса посевного (Avena sativa L., сорт Скакун), риса культурного (Orysa sativа L., образец ВИР К-4573), редиса посевного (Raphanus sativus L. var radicüla, сорт Жара), гороха посевного (Pisum sativum L., сорт Чишминский), арахиса подземного (Arachis hypogaea L.), козлятника восточного (Galega orientalis Lam.), табака (Nicotiana tabacum Link et Otto), огурца посевного (Cucumis sativus L., сорт Либелла), цукини (Cucurbita pepo L., сорт Сувенир), корни хрена деревенского (Armoracia rusticana Gaertn., Mey. et 8епегЪ) и этиолированные проростки картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Невский).

Хитин («Fluka», Швейцария) размалывали на зерновой мельнице и заливали 2 М раствором HCl при комнатной температуре и через 2 ч промывали водой. Затем хитин заливали 1 М раствором NaOH и грели на водяной бане при 96° в течение 2—3 ч при пяти-шести сменах раствора. После этого сорбент промывали водой до нейтрального значения рН. Хроматографическую колонку (2 х 6 см) заполняли суспензией хитина и уравновешивали 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0.

Растительный материал обрабатывали холодным ацетоном и готовили экстракт по описанному ранее методу [19]. Экстракт наносили при комнатной температуре на колонку с хитином. Колонку промывали до величины поглощения при 280 нм не более 0,005 и затем элюи-ровали 1 М раствором №С1 белки, связавшиеся с хитином. Скорость протекания растворов через колонку 30 мл/ч.

Активность пероксидазы в аликвотах хрома-тографических фракций определяли микрометодом. Плоскодонные полистироловые планшеты («Linbro», Flow Laboratories, Англия) заливали 0,075 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 5,8, содержавшего 0,025 мл ферментного образца, 0,025 мл раствора о-фенилендиамина в концентрации 0,5 мг/мл и 0,025 мл H2O2. Развитие окраски останавливали добавлением 0,050 мл раствора 2 М H2SO4. Планшет сканировали на приборе IFCO-2 (Россия) при 492 нм. Содержание белка определяли методом Брэдфорд [19].

Изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе завода Хийу-Каллур (Эстония) согласно рекомендациям фирмы в 7%-ном полиак-риламидном геле (ПААГ), содержавшем 10%-ный глицерин и 1,5%-ные амфолины, рН 3,5—10 («LKB», Швеция). В качестве анодного буфера использовали 0,02 М H3PO4, катодного — 0,1 М NaOH. В качестве маркера использовали гемоглобин человека с pI 7,0 [20]. Перед нанесением на гель образцы выравнивали по содержанию белка.

Активность изопероксидазы в геле выявляли 0,01%-ным раствором 3,3-диаминобензидина солянокислого с 0,005%-ной Н202 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,0. Изоферменты с р1 менее 7,0 и расположенные в геле между анодом и маркерным белком мы назвали анионными, а между катодом и маркерным белком — катионными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из приведенных в таблице данных видно, что активность фермента у испытанных видов растений на хитине повышалась. Характерно то, что это повышение иногда наблюдается во фракции, не связавшейся с хитином, а иногда и во фракции, элюирующейся с этого биополимера 1 М раствором ^аС1. Например, у картофеля пероксидазная активность возрастала в 4 раза (таблица) во фракции, не связавшейся с хитином, за счет анионной изопероксидазы.

Наличие пероксидазной активности в хитиновом элюате свидетельствовало об ионообменной сорбции некоторых изоформ пероксидазы, как и у пшеницы [18]. В связи с этим мы провели изоэлектрофокусирование белковых препаратов, полученных после хроматографии (рисунок). Можно заметить, что у всех изученных видов растений на этот биополимер сорбируются крайние анионные изопероксидазы с изоэлект-рической точкой, близкой к 3—3,5 (рисунок). У картофеля, в отличие от отмеченных выше видов растений, эта изопероксидаза не сорбировалась на хитин, но многократно повышала свою активность. На хитин же сорбировалась другая анионная изопероксидаза, с более высокой изо-электрической точкой.

На рисунке представлены результаты изоэлект-рофокусирования пероксидазы, выделенной из проростков риса культурного, овса посевного, редиса посевного, гороха посевного, арахиса подземного, козлятника восточного, табака, огурца посевного, цукини, этиолированных проростков картофеля и корней хрена деревенского. Как видно, у растений, относящихся к семействам бобовых и тыквенных (горох, арахис, козлятник, огурец, цукини), в отличие от других видов растений, на хитин могут активно сорбироваться и катионные изопероксидазы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Считается, что активация защитных белков при патогенезе представляется системной ответной реакцией, предполагающей довольно длительный и многоступенчатый перенос информации

Влияние хитина на активность пероксидазы (усл. ед. на 1 мг белка) в белковых экстрактах из различных видов растений

Вид Активность пероксидазы, усл. ед. на 1 мг белка Количество изопероксидаз

грубый экстракт фракция, не связывающаяся с хитином солевой элюент всего в грубом экстракте сорбируется на хитин

Пшеница мягкая 10,5 ± 1,2 4,3 ± 0,5 11,0 ± 3,0 9 1

Овес посевной 3,6 ± 0,5 3,1 ± 0,1 11,2 ± 2,5 10 2

Рис культурный 1,7 ± 0,2 4,9 ± 0,6 0,5 ± 0,1 17 2

Хрен деревенский 7,0 ± 1,0 19,2 ± 2,3 2,0 ± 0,1 8 2

Редис посевной 9,0 ± 1,0 11,3 ± 2,0 2,9 ± 0,2 6 1

Картофель 1,9 ± 0,2 6,8 ± 1,1 1,6 ± 0,1 18 1

Табак 2,4 ± 0,9 9,0 ± 0,9 13,7 ± 2,0 6 1

Арахис подземный 8,2 ± 1,1 1,3 ± 0,1 6,1 ± 0,9 12 6

Горох посевной 3,8 ± 0,3 2,9 ± 0,5 36,2 ± 3,9 11 6

Козлятник восточный 3,9 ± 0,5 4,3 ± 0,1 4,2 ± 0,1 11 6

Огурец посевной 9,8 ± 0,5 1,9 ± 0,1 13,5 ± 0,9 5 4

Цукини 6,2 ± 0,6 1,7 ± 0,1 5,1 ± 0,8 4 4

внутрь растительной клетки и синтез патоген-индуцируемых белков (PR-белков) de novo [21]. Однако пероксидаза как фермент, необходимый для нормального функционирования растительной клетки [22], в отличие от других PR-белков, конститутивно присутствует в растении. При этом стрессовые воздействия, в особенности биотической природы, как правило, индуцируют активность этого фермента [10].

Нами определено, что в присутствии хитина происходит повышение пероксидазной активности у всех испытанных видов растений в сравнении с ее активностью в грубом растительном экстракте. Причем активация пероксидазы может происходить как во фракции, сорбирующейся на хитин, так и во фракции, не связывающейся с ним. Эти результаты подтверждают в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком