ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 417, № 6, с. 830-834
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ МОЗГА И ЭРИТРОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ОБЛАДАЮТ ОДИНАКОВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ДЕЙСТВИЮ НЕКОТОРЫХ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ
ИНГИБИТОРОВ
© 2007 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 23.05.2007 г. Поступило 23.05.2007 г.
При изучении представителей одной из самых многочисленных эстеразных группировок - семейства холинэстераз (ХЭ) [1-3] возникает ряд системных проблем. С одной стороны, благодаря выраженной видовой и тканевой специфичности [1-3] семейство ХЭ представляет собой набор ферментов с разнообразнейшим спектром энзи-мологических свойств. С другой стороны, все эти ферменты должны быть помещены в "прокрустово ложе" двух позиций Номенклатуры ферментов под систематическими названиями аце-тилхолин-ацетилгидролаза (НФ 3.1.1.7) и ацилхо-лин-ацилгидролаза (НФ 3.1.1.8) [4]. Принято считать "реперными" ХЭ в каждой из номинаций соответственно ацетилхолинэстеразу (АХЭ) эритроцитов крови быка и бутирилхолинэстеразу (БХЭ) сыворотки крови лошади [1-3]. Для построения логичной классификационной схемы нужны результаты субстратно-ингибиторного анализа препаратов ХЭ, и здесь мы отдаем предпочтение исследованиям с такими высокоспецифическими ан-тихолинэстеразными эффекторами, как фосфор-органические ингибиторы (ФОИ), взаимодействие которых с ХЭ имеет достаточно строго количественную меру - биомолекулярную константу скорости реакции кп [1-3]. В недавно опубликованной монографии [3] приведены подробные данные по сравнительной чувствительности ХЭ различного происхождения к ФОИ разной структуры. Так, с помощью ФОИ были тестированы многие десятки препаратов ХЭ из органов и тканей животных, стоящих на различных уровнях эволюционного развития. И здесь неожиданно оказалось, что беднее всего представлены ХЭ млекопитающих и совсем единичны исследования чувствительности ХЭ разных органов и тканей одного вида животного.
В связи с этим мы предприняли исследование действия нескольких разнящихся по структуре ФОИ на активность нативных (неочищенных) хо-линэстеразных препаратов из мозга, эритроцитов и сыворотки у отдельных представителей небольшой, в достаточной степени произвольно составленной группы млекопитающих. Тестированные ФОИ, будучи гидрофобными соединениями, имели между собой определенные различия (формулы см. ниже). Это проявилось, во-первых, в строении фос-форильной части молекулы: этоксиметильные (соединения I и III) и диэтоксипроизводные (соединения II и IV), что считается существенным при сравнении типичных АХЭ и БХЭ (первые более специфичны к АХЭ, вторые - к БХЭ) [1-3]. Во-вторых, различалась структура отщепляющейся при фосфорилировании ХЭ-группировки молекулы ФОИ: это либо 3,3-диметилбутильные ("нео-гексильные") производные (соединения I и II), либо норм.гексильные аналоги (соединения III и IV), что оказалось очень важным, например, при сравнительных исследованиях ХЭ нервной ткани тихоокеанских кальмаров [2, 3, 5, 6]. И, наконец, в-третьих, изученные ФОИ представляют собой две пары изомерных соединений - соединения I и III и соединения II и IV, что интересно в плане оценки влияния изомерного эффекта на проявление антихолинэстеразного действия ФОИ по отношению к разным препаратам ХЭ.
Тканевыми препаратами ХЭ различных представителей млекопитающих служили либо гомогенизированные в 0.1 М KCl образцы мозговой ткани, либо фракция эритроцитов крови, либо сыворотка крови животных [7]. Препараты ХЭ не подвергались какой-либо белковой очистке и тем самым могли считаться нативными. В качестве субстрата ХЭ использовали коммерческий препарат ацетилхолинхлорида ("Merck"). Определение активности ХЭ проводили методом непрерывного потенциометрического титрования [1, 2]. Фосфорорганические ингибиторы (ФОИ) были синтезированы в Институте элементоорга-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Таблица 1. Сравнительная чувствительность к некоторым ФОИ у ХЭ мозга и эритроцитов одного и того же животного
Вид животного Параметр Фосфорорганический ингибитор Отношение величин k ii
I II III IV I/II III/IV I/III II/IV
Человек lg hi (м) 3.95 2.20 4.41 1.79 55 420 0.3 3
lg kn (э) 3.84 2.11 4.54 1.86
кц (м)/кц (э) 1.3 1.1 0.8 0.8
Кролик lg kn (м) 4.14 2.11 4.45 1.84 100 400 0.5 2
lg kn (э) 4.16 2.14 4.41 1.92
kn (м)/ кц (э) 1.0 0.9 1.1 0.8
Крыса lg kn (м) 3.46 1.11 4.00 1.90 220 130 0.3 0.2
lg kn (э) 3.43 1.15 4.01 1.89
kn (м)/ kn (э) 1.1 0.9 1.0 1.0
Бык lg kn (м) 3.80 1.67 3.92 1.53 130 250 1 1
lg kn (э) 3.71 1.75 4.04 1.50
kn (мУ^д (э) 1.2 0.8 0.8 1.1
Собака lg kn (м) 3.00 1.04 3.18 1.15 100 100 1 1
lg kn (э) 2.89 1.04 3.30 1.11
kn (м)Ап (э) 1.3 1.0 0.8 1.1
Кошка lg kn (м) 3.04 0.95 3.00 0.95 130 110 1 1
lg kn (э) 3.14 1.20 3.18 1.06
kn (м)Ап (э) 0.8 0.6 0.8 0.8
Примечание. Здесь и в табл. 2: ^ (м) и ^ ^ (э) - логарифм биомолекулярной константы скорости взаимодействия ингибитора с ХЭ мозга и ХЭ эритроцитов соответственно одного и того же животного.
нических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН
[1-3]:
соединение I - О-этил-8-(3,3-диметилбутил)тио-фосфонат, С2Н50(СН3)Р(0)8(СН2)2С(СН3)3;
соединение II - О,О-диэтил-8-(3,3-диметилбу-тил)тиофосфат, (С2Н50)2Р(0)8(СН2)2С(СН3)3;
соединение III - О-этил-8-норм.гексилметил-тиофосфонат, С2Н50(СН3)Р(0)8С6Н13;
соединение IV - О,О-диэтил-8-норм.гексил-тиофосфат, (С2Н50)2Р(0)8С6Н13. Мерой антихо-линэстеразной эффективности ФОИ служила бимолекулярная константа скорости взаимодействия ХЭ с ФОИ (кп) [1-3], представленная в табл. 1-3 в виде логарифма (кп).
В табл. 1 представлены данные по сравнению чувствительности к исследованным четырем гидрофобным ФОИ у неочищенных нативных препаратов ХЭ мозга и эритроцитов млекопитающих. Во-первых, отмечен весьма любопытный и нетривиальный факт поразительного сходства в эффективности тестированных ФОИ по отношению к ХЭ мозга и ХЭ эритроцитов одного вида животного. Величины отношения констант кп для каждого из ФОИ у мозговой и эритроцитарной ХЭ колебались в пределах от 1.3 до 0.75. Во-вто-
рых, феномен сходства чувствительности ХЭ мозга и эритроцитов одного вида животного наблюдался на фоне достаточно существенных различий в величинах кп для разных животных: так, III было в 30 раз более сильным ингибитором ХЭ мозга и ХЭ эритроцитов кролика и человека, чем соответствующих ферментов кошки, а по отношению к II различие между чувствительностью ферментов человека и кошки было почти 20-кратным. И для других ФОН различия в величинах эффективности по отношению к ХЭ разных животных были более чем 10-кратными. В-третьих, как отмечалось выше, тестированные ФОН, сходные по своим физико-химическим свойствам, будучи гидрофобными соединениями, имели между собой определенные отличия в строении фосфо-рильной части молекулы (этоксиметильные (I и III) и диэтоксипроизводные (II и IV)), а также в структуре отщепляющейся группировки (это были либо 3,3-диметилбутильные ("неогексиль-ные") производные (I и II), либо норм.гексильные аналоги (III и IV)). Оказалось, что мозговые и эритроцитарные препараты ХЭ были более чувствительны к изменениям в фосфорильной части молекулы ФОИ: этоксиметильные производные (I и III) проявили себя как значительно более эффективные (в 100-400 раз) ингибиторы фермен-
Таблица 2. Сравнительная чувствительность ХЭ мозга и сыворотки крови одного и того же животного к некоторым ФОИ
Вид животного Параметр Фосфорорганический ингибитор Отношение величин k ii
I II III IV I/II III/IV I/III II/IV
Человек lg кп (м) 3.95 2.20 4.41 1.79 55 420 0.3 3
lg kn (c) 3.11 3.18 3.49 2.99 1 30 0.5 1
kll (м)/ kn (c) 5 0.1 10 0.05
Кролик lg kii (м) 4.14 2.11 4.45 1.84 100 400 0.5 2
lg kii (c) 3.42 2.18 3.87 1.95 40 100 0.3 1
kll (м)/ kn (c) 10 1 5 1
Крыса lg kii (м) 3.46 1.11 4.00 1.90 220 130 0.3 0.2
lg kii (c) 3.75 2.64 3.72 2.40 10 20 1 2
kii (м)/ kii (c) 1 0.05 1 0.5
Собака lg kii (м) 3.00 1.04 3.18 1.15 100 100 1 1
lg kii (c) 3.16 2.76 3.69 2.65 2 10 0.3 1
kii (м)/ kii (c) 1 0.01 0.5 0.05
Кошка lg kii (м) 3.04 0.95 3.00 0.95 130 110 1 1
lg kii (c) 3.39 3.20 3.88 2.81 1 10 0.3 2
kii (м)/ kii (c) 0.5 0.05 0.1 0.01
Таблица 3. Чувствительность к изученным ФОИ у очищенных и нативных препаратов ХЭ эритроцитов и сыворотки млекопитающих и у препаратов ХЭ нервной ткани тихоокеанских кальмаров [5, 6, 8]
Фосфорорганический Отношение
Источник фермента ингибитор (lg kii) величин kii
I II III IV I/II III/IV I/III II/IV
Очищенный препарат АХЭ эритроцитов крови быка 3.20 2.90 4.20 3.58 2 4 0.1 0.2
Очищенный препарат АХЭ эритроцитов крови человека 3.50 - 4.54 - - - 0.1 -
Нативный препарат ХЭ эритроцитов крови человека 3.84 2.11 4.54 1.86 55 420 0.3 3
быка 3.71 1.75 4.04 1.50 130 250 1 1
кролика 4.16 2.14 4.41 1.92 100 400 0.5 2
крысы 3.43 1.15 4.01 1.89 220 130 0.3 0.2
собаки 2.89 1.04 3.30 1.11 100 100 1 1
кошки 3.14 1.20 3.18 1.06 110 110 1 1
Очищенный препарат БХЭ сыворотки крови лошади 3.67 3.54 4.58 4.52 1 0.1 0.1 0.1
Нативный препарат ХЭ сыворотки крови человека 3.11 3.18 3.49 2.99 1 3 0.5 1
кролика 3.42 2.18 3.87 1.95 40 100 0.3 1
крысы 3.75 2.64 3.72 2.40 10 20 1 2
собаки 3.16 2.76 3.79 2.65 2 10 0.3 1
кошки 3.39 3.20 3.88 2.81 1 10 0.3 2
ХЭ ганглиев кальмара Т. рааАсш 6.42 5.32 5.36 3.92 15 30 15 30
ХЭ ганглиев кальмара В. magister 5.80 4.23 3.60 3.18 35 2 160 10
тов каждого из животных. Степень разветвленно-сти алкильного радикала в отщепляющейся группировке (I и II, III и IV) если и оказывала, то несравненно меньшее влияние на антихолинэсте-
разное действие ФОИ. И здесь можно говорить о межвидовых различиях: чувствительность ферментов человека и кролика несколько в большей степени проявила зависимость от структуры
ФОИ. В-четвертых, проявление изомерного эффекта (соединения I и III и соединения II и IV), как отмечалось выше, в большей мере относилось к паре I и III, так как препараты ХЭ мозга и эритроцитов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.