ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.51
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОКСИФЛОКСАЦИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
ФАРМАКОКИНЕТИКИ © 2015 г. И. С. Ярошенко*, ^ А. Я. Хайменов**, А. В. Григорьев***, А. А. Сидорова***
*Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 26
1E-mail: irina.s.yaroshenko@gmail.com **Представительство фирмы "Д-р Редди 'с Лабораторис Лтд" в РФ 115035 Москва, Овчинниковская наб., 20, стр. 1 ***Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, ЦКП "Аналитическая спектрометрия'
195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27, а/я 27 Поступила в редакцию 05.02.2014 г., после доработки 28.04.2014 г.
Разработана и валидирована методика определения моксифлоксацина в плазме крови человека методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке (150 х 2.0 мм) YMC-Triart C18 (3 мкм) с масс-спек-трометрическим детектированием. Пробоподготовка заключалась в твердофазной экстракции на патронах Waters Sep-Pak. Степень извлечения моксифлоксацина 90 ± 3%. Детектирование проводили квадрупольным масс-анализатором с ионизацией электрораспылением по значениям m/z 402.2 и 362.2 для моксифлоксацина и офлоксацина (внутренний стандарт) соответственно. Нижняя граница линейного диапазона определяемых содержаний 1 нг/мл. Разработанная методика применена для исследования фармакокинетики моксифлоксацина.
Ключевые слова: моксифлоксацин, фторхинолоны, ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, твердофазная экстракция, биоэквивалентность.
DOI: 10.7868/S0044450215050187
Моксифлоксацин относится к ряду фторхино-лонов (ФХ), важному классу синтетических антибиотиков широкого спектра действия [1]. Это большая и постоянно расширяющаяся группа соединений, структурно родственных благодаря наличию атома фтора и конденсированных колец с атомом азота:
O O
R
HO
F
N у N I I I R R R
.R
(1)
отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, анаэробных, кислотоустойчивых и атипичных бактерий.
O O
HO
(2)
Ряд фторхинолонов стал доступен для использования с появлением ципрофлоксацина в конце 80-х годов [2]. Существуют четыре поколения ФХ. Ло-мефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, ле-вофлоксацин, спарфлоксацин и моксифлоксацин входят в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (табл. 1).
Моксифлоксацин (см. ниже) относится к четвертому поколению ФХ, проявляет активность в
Препараты, содержащие моксифлоксацин, применяют при инфекциях верхних и нижних дыхательных путей (острый синусит, обострение хронического бронхита, внебольничная пневмония), а также инфекциях кожи и мягких тканей [3]. Имеются сведения, что моксифлоксацин обладает высокой биодоступностью: концентрация препарата в крови после перорального приема сопоставима с концентрацией после внутривенного введения. Его характеризуют как препарат с достаточно длительным периодом полувыведения и хорошим проникновением в ткани организма [1].
Таблица 1. Фторхинолоны и спектр их действия
Поколение Препараты Спектр действия
I Нефторированные хинолоны: налидиксовая Активны в основном в отношении грам(-)
кислота, оксолиниевая кислота, пипемидиевая флоры
кислота
II "Грамотрицательные" фторхинолоны: нор- Появляется широкий спектр действия: грам(-)
флоксацин, ципрофлоксацин, пефлоксацин, флора, некоторая грам(+) флора
офлоксацин, ломефлоксацин
III "Респираторные" фторхинолоны: левофлокса-цин, спарфлоксацин Активность против кокковой и атипичной флоры
IV "Респираторные" и "антианаэробные" фторхи- Активность в отношении грам(-), грам(+), ати-
нолоны: моксифлоксацин, гемифлоксацин, га- пичной флоры и анаэробных инфекций
тифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин
По данным издательства Elsevier интерес к изучению моксифлоксацина за последние 15 лет неуклонно возрастает (рис. 1). Исследовали различные биологические объекты: мочу [4—6], сыворотку [2, 7] и плазму крови [1, 4, 6, 8—18], слюну [4, 19] и даже слезную жидкость [20]. Особое значение имеет мониторинг концентрации мокси-флоксацина в плазме крови для достижения оптимального режима дозирования и предотвращения бактериальной резистентности. Для этого необходимы простые и адекватные аналитические методики, которые могут быть легко применимы в клинической практике.
Среди описанных методов определения моксифлоксацина квадратно-импульсная вольтампе-рометрия [5], капиллярный электрофорез [8], атомно-абсорбционная спектрометрия, кондук-тометрия и фотометрия [21]. Однако подавляющее большинство исследований проводили с использованием хроматографических методов: тонкослойной хроматографии с денситометрическим детек-
тированием [22, 23], ВЭЖХ с ультрафиолетовым [12, 13, 17, 24], флуоресцентным [1, 2, 4, 6, 7, 9-11, 13—15, 18-20, 25] и масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС) [16, 26, 27]. Работ по хромато-масс-спектрометрическому определению очень мало, а в тех, что представлены, используют наиболее сложный аппаратурно и дорогостоящий тандемный вариант.
При фармакологическом контроле моксифлок-сацина в плазме крови применяют различные методы пробоподготовки: жидкостно—жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) дихлорметаном из щелочного раствора плазмы [17], твердофазную экстракцию (ТФЭ) на патронах OASIS HLB [12, 16], в большинстве работ проводят осаждение белков ацетонитрилом из кислого раствора плазмы [1, 4, 6, 9, 10, 14]. Описан также способ пробоподготовки, сочетающий осаждение белков метанолом, получение производных с 4-хлоро-7-нитробензо-диоксазолом и трехкратную экстракцию этилаце-татом [15].
1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012
Год издания
Рис. 1. Рост числа публикаций, посвященных исследованию моксифлоксацина, за последние 15 лет.
Таблица 2. Сравнение методик определения моксифлоксацина в плазме крови методом ВЭ
Детектор Пробоподготовка Диапазон линейности, нг/мл сн, нг/мл Исследование фармакокинетики Доза, мг Литература
ФЛ Осаждение белков ацето- 40-5000 20 + 400 [1]
нитрилом
ФЛ Осаждение белков смесью 5-1500 3 + 200 [4]
Н3Р04 и ацетонитрила
ФЛ Осаждение белков ацето- 20-4000 10 + 400 [6]
нитрилом
ФЛ То же 300-7000 100 + 400 [9]
ФЛ Осаждение белков НСЮ4 125-10000 75 + 400 [10]
ФЛ Фильтрация белков, ТФЭ 3-1300 1 + 400 [11]
УФ ТФЭ 25-3200 6 - - [12]
УФ Осаждение белков смесью 100-10000 50
ацетонитрила
ФЛ и фосфатного буфера 20-5000 10 - - [13]
ФЛ Осаждение белков смесью 20-7500 5 + 400 [14]
Н3Р04 и ацетонитрила
ФЛ Осаждение белков мета- 15-2700 6 + 400 [15]
нолом
МС ТФЭ 1-1000 0.5 - - [16]
УФ ЖЖЭ дихлорметаном 50-5000 15 + 400 [17]
МС Осаждение белков мета- 50-6000 30 + 400 [27]
нолом
ФЛ — флуоресцентный, УФ — ультрафиолетовый, МС — масс-спектрометрический.
В зависимости от способа пробоподготовки и детектирования получены довольно широкие линейные диапазоны определяемых концентраций моксифлоксацина в плазме крови: 1—1000 нг/мл для ТФЭ и тандемной масс-спектрометрии [16], 50—10000 нг/мл для ЖЖЭ и ультрафиолетового детектирования [17] при дозировке моксифлоксацина 200 или 400 мг. В качестве внутреннего стандарта при определении моксифлоксацина применяют практически весь спектр фторхино-лонов, близких по структуре и соответственно по параметрам удерживания в хроматографической колонке. Среди них сарафлоксацин [14, 20], энро-флоксацин [12], норфлоксацин [1, 15], ломефлок-сацин [16], гатифлоксацин [6, 7, 17], офлоксацин [4, 10, 11, 19]. Сравнение методик определения моксифлоксацина в плазме крови представлено в табл. 2.
Цель данной работы — разработка экспрессной, надежной и доступной методики определения моксифлоксацина в плазме крови методом ВЭЖХ—МС с использованием офлоксацина (см. ниже) в качестве внутреннего стандарта и селективного выделения аналитов на сорбенте Waters Sep-Pak твердофазной экстракцией.
O O
, -F
HO
(3)
N j N H
H3C vr ^ CH3
Разработанная методика валидирована в соответствии с современными международными критериями [28—30], позволяет определять мокси-флоксацин в широком диапазоне концентраций (1—2500 нг/мл). Методика успешно применена для исследования сравнительной фармакокине-тики и биоэквивалентности двух препаратов, содержащих моксифлоксацин.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты и материалы. Стандартные вещества — моксифлоксацина гидрохлорид и офлоксацин (EDQM, Франция). Для приготовления подвижной фазы и проведения пробоподготовки использовали этилацетат (Sigma-Aldrich, США), трет-бутилметиловый эфир (Sigma-Aldrich, США), ацетонитрил (Biosolve, Франция), метанол (Merck, Нидерланды), муравьиную кислоту (Flu-
ka, Германия), формиат аммония (Fluka, США), диэтиламин (Вектон, Россия), гидроксид натрия (Merck, Германия), соляную кислоту (BioReagent, Германия), деионированную воду, очищенную с помощью системы Milli Q Advantage A10, патроны для ТФЭ Sep-Pac®Vac tC18 (100 мг, 1 мл) (Waters, Ирландия).
Аппаратура. Работу выполняли на жидкостном хроматографе Agilent 1100, укомплектованном градиентным насосом, термостатируемым автодозатором, масс-спектрометрическим детектором с ионизацией электрораспылением и квадру-польным масс-анализатором. Разделение проводили на колонке (150 х 2.0 мм) YMC-Triart C18 (3 мкм, 12 нм) с предколонкой (10 х 2.1 мм) YMC-Triart C18 (5 мкм, 12 нм). ЖЖЭ и осаждение белков выполняли с помощью встряхивателя Heidolf Multi Reax. Для проведения ТФЭ применяли вакуумный насос GAST и систему для ТФЭ Waters. Также использовали микродозаторы переменного объема Biohit, электронные весы Ohaus Discovery, центрифугу Eppendorf Centrifuge 5415R, термостат BIOSAN CH-100 с функцией нагрева и охлаждения, систему для выпаривания Turbo"Vp LV (Calliper). Для исследования стабильности использовали биомедицинские морозильники Sanyo (от -18 до —40°C и от -60 до -80°C).
Приготовление стандартных растворов. Стандартные растворы моксифлоксацина и офлокса-цина с концентрацией 1 мг/мл готовили в мерных колбах емк. 25 мл растворением точной навески стандартных веществ в метаноле. Полученные растворы стабильны в течение месяца при -25 ± 3°С. Растворы с концентрациями от 1 до 2500 нг/мл г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.