ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.54:543.51:543.05
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И МОЧЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКСТРАКТИВНОГО АЛКИЛИРОВАНИЯ © 2015 г. А. И. Уколов1, Т. И. Орлова, Е. И. Савельева, А. С. Радилов
Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека Федерального медико-биологического агентства 188663 Ленинградская обл., Всеволожский район, г. п. Кузьмоловский, ст. Капитолово, корп. № 93 1Е-таИ: AntonUkolov@gmail.com Поступила в редакцию 08.08.2014 г., после доработки 15.12.2014 г.
Предложена методика экстрактивного алкилирования свободных жирных кислот (СЖК) в плазме крови и моче для их последующего хромато-масс-спектрометрического определения в виде метиловых эфиров. Перечень целевых соединений включает 19 насыщенных кислот (С6—С24) и 20 ненасыщенных кислот (С16—С24), в том числе ю-3, ю-6, ю-9 и полиненасыщенные жирные кислоты. Для одновременного извлечения СЖК из матрицы и дериватизации использован метод экстрактивного алкилирования иодистым метилом. Особенностью и преимуществом методики является объединение стадий экстракции и получения летучих производных в мягких условиях. Степень извлечения/превращения составляет от 60 до 90%. Линейный диапазон определяемых концентраций составил от 0.02 до 20 мкг/мл образца. Оценено влияние условий хранения образцов на результаты измерений. Методика апробирована при определении СЖК в плазме крови и моче добровольцев и лабораторных животных.
Ключевые слова: кровь, свободные жирные кислоты, экстрактивное алкилирование, хромато-масс-спектрометрия.
Б01: 10.7868/80044450215090170
Термин "жирные кислоты" (ЖК) объединяет химический класс алифатических одноосновных карбоновых кислот с открытой цепью. Нарушение метаболизма свободных жирных кислот приводит к патологическим последствиям [1]. В последнее время возможность определения жирных кислот играет большую роль в диагностике метаболического синдрома, наследственных, онкологических заболеваний [2]. Следует учитывать, что в плазме ЖК находятся в этерифицированном и неэтерифицированном видах, поэтому для определения биомаркеров различных заболеваний существенное значение имеет раздельное определение свободных и этерифицированных жирных кислот. Большая часть работ посвящена их определению в плазме. В моче ЖК определяют значительно реже [3].
Наиболее распространенным методом определения ЖК является газовая хроматография с различными видами детектирования. Однако метод газовой хроматографии требует предварительной дериватизации СЖК [4, 5], наиболее распространенным способами получения производных явля-
ется метилирование и триметилсилилирование [6]. В качестве дериватизирующего агента для метилирования чаще всего используют безводный метанол с добавлением щелочного катализатора, например КОН. Известны методы одновременного определения этерифицированных и свободных жирных кислот [7].
Одними из главных недостатков метилирования являются длительность реакции и высокая температура, что приводит к изомеризации и окислению ненасыщенных жирных кислот. Обеспечение мягких условий пробоподготовки позволяет определять низкие эндогенные концентрации полиненасыщенных ЖК и эйкозаноидов.
В качестве методики дериватизации и экстракции для последующего определения свободных жирных кислот нами выбрано экстрактивное алкилирование иодистым метилом. Методика экстрактивного алкилирования СЖК иодистым метилом была предложена в работе [8]. Экстрактивное алкилирование различными реагентами (иодистым метилом, диазометаном, фенацил- и бензилгалоге-нидами и пр.) используют для дериватизации ана-
литов в биологических образцах, например, диуретиков [9], метаболитов тетрагидроканнабинола [10], бупренорфина [11]. Преимущество экстрактивного алкилирования — объединение стадий экстракции и получения летучих производных. Реакции протекают в мягких условиях, причем использование межфазных агентов позволяет значительно уменьшить продолжительность реакций и увеличить выходы продуктов. Предложена методика определения СЖК в плазме крови методом экстрактивного алкилирования с использованием в качестве дериватизирующего/экстрагирующего компонента раствора диазометана в эфире [12]. Авторы не приводят сведений о достигаемых степенях извлечения/превращения аналитов и воспроизводимости результатов. Недостатками методики являются необходимость использования высокотоксичного и нестойкого диазометана и значительная взаимная растворимость отдающей и принимающей фаз. Использование хорошо отделяющихся от водной фазы экстрагентов возможно при использовании катализаторов межфазного переноса. В качестве последних обычно используют четвертичные аммониевые, фосфониевые или другие ониевые соли. Впервые межфазные катализаторы для экстрактивного алкилирования предложены в работе [13].
Экстрактивное алкилирование по нашему мнению является лучшим методом при определении СЖК в силу следующих причин: 1) алкилиру-ются и определяются только свободные жирные кислоты; 2) гидролиз и переэтерификация липидов в условиях экстрактивного алкилирования протекают в незначительной степени и не вносят заметного вклада в результаты определения СЖК [8]; 3) реакция протекает при комнатной температуре, что препятствует изомеризации полиненасыщенных кислот в составе биологических образцов.
Цель настоящей работы — разработка методики определения свободных жирных кислот в плазме крови и моче с использованием экстрактивного алкилирования и газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Оптимизированы условия подготовки проб, дериватиза-ции, хроматографического разделения и масс-се-лективного детектирования. Исследовано влияние условий хранения биологических образцов: температуры и продолжительности хранения на результат определения СЖК в плазме крови.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и стандарты. В качестве стандартных образцов использовали смесь метиловых эфиров жирных кислот (F.A.M.E. Mix C4-C24, Supelco, кат № 18919), набор стандартов насыщенных жирных кислот с нечетным числом атомов углерода (Supelco, кат № OC9-1KT), с четным числом атомов углерода (Supelco, кат № EC10A-1KT) и
ненасыщенных жирных кислот (Supelco, кат № UN10-1KT). Внутренний стандарт — дейтери-рованная пальмитиновая кислота d31 (Supelco, кат № 366897). Дихлорметан, JTBaker; иодистый метил, Sigma-Aldrich; водный раствор гидроксида тетрабутиламмония, Sigma-Aldrich.
Подготовка образцов для анализа. Образец плазмы крови или мочи объемом 0.5 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования емк. 15 мл и прибавляли 10 мкл внутреннего стандарта (раствор пальмитиновой кислоты d31 с концентрацией 5 мг/мл). К полученному раствору прибавляли 2 мл фосфатного буферного раствора с pH 8, 140 мкл 0.2 М раствора гидроксида тетра-бутиламония, 200 мкл иодистого метила и 2 мл ди-хлорметана. Полученную смесь тщательно перемешивали 15 мин. Затем смесь центрифугировали 3 мин при 4000 об/мин, отделяли и отбрасывали водный верхний слой, а в нижний органический слой добавляли осушитель — безводный Na2SO4. Тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость в пробирки емк. 2 мл. Полученный раствор выпаривали под током азота до конечного объема около 50 мкл. Затем пробу разбавляли 50 мкл гексана и перемешивали в вортексе в течение 10 мин, после чего раствор переносили в виалу емк. 100 мкл и анализировали 1 мкл.
Хромато-масс-спектрометрическое определение. Для определения метиловых эфиров СЖК использовали газовый хроматограф Agilent 7890A с масс-селективным детектором Agilent 5975С. Газовый хроматограф оборудован капиллярной колонкой HP-5MS 30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм. Условия анализа суммированы в табл. 1. Аналитические характеристики метиловых эфиров целевых жирных кислот, времена удерживания и характеристичные m/z приведены в табл. 2.
Оценка влияния условий хранения на результат анализа. Для определения влияния температуры и продолжительности хранения биологических образцов была отобрана плазма крови у четырех крыс, каждая проба была разделена на три части. Первую аликвоту анализировали сразу же, а вторую и третью хранили 2 мес. при —20 и —70°С, после чего пробы размораживали и анализировали.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При разработке методики определения СЖК значительную проблему представляет подбор условий хроматографического разделения метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, поэтому на предварительном этапе исследований оптимизировали условия хроматографического разделения.
Выбор условий хроматографического разделения. Сравнивали эффективности разделения метиловых эфиров ЖК на капиллярных колонках: HP-
Таблица 1. Условия газохроматографического разделения и масс-селективного детектирования метиловых эфи-ров жирных кислот
Условия анализа Характеристики
Газ-носитель Гелий газообразный высокой чистоты марки 6.0, объемная доля гелия не менее 99.9999 об. %
Режим ввода пробы Объем пробы 1 мкл, без деления потока (1 мин), под давлением 69 кПа
Температурный режим термостата колонки 3 мин при 50°С, затем подъем до 140°С со скоростью 20 град/мин, затем подъем до 280°С со скоростью 5 град/мин, затем 8 мин при конечной температуре
Температура инжектора 250°С
Объемная скорость газа-носителя через колонку 1 мл/мин
Режим работы масс-спектрометра Ионизация электронами с энергией 70 эВ, температура источника ионов 280°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса 280°С, масс-селективное детектирование в режиме мониторинга избранных ионов (SIM), см. табл. 2
FFAP Polyethylene Glycol, SUPELCO SPB-1701 30 м x 0.250 мм х 0.25 мкм и HP-5MS 30 м х х 0.25 мм х 0.25 мкм.
Режимы программирования температуры при использовании колонки HP-FFAP Polyethylene Glycol: начальная температура термостата 50°С, конечная 200°С, скорость подъема температуры варьировали от 5 до 20 град/мин, в том числе с использованием "ступенчатого" температурного градиента.
Форма хроматографических пиков наиболее легких компонентов смеси симметрична, однако при достижении 200° С форма пиков тяжелых компонентов не позволяла количественно оценить их площади.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.