ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОМ ХИМИИ, 2007, том 62, № 5, с. 510-514
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544.45:543.51
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ЗОПИКЛОНАВ МОЧЕ
© 2007 г. С. С. Катаев*, Н. Б. Зеленина*, Ю. А. Хомов**, Н. В. Кокшарова**, М. Дайех**
*Пермское областное бюро судебно-медицинской экспертизы 614077 Пермь, ул. Старцева, 61 **Пермская государственная фармацевтическая академия
614000 Пермь, ул. Ленина, 48 Поступила в редакцию 28.12.2005 г., после доработки 01.08.2006 г.
Описана методика количественного определения зопиклона и суммы его основных метаболитов в моче с использованием газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием по общему для них продукту гидролиза - 6-(5-хлор-2-пиридил)-7-гидрокси-6,7-дигидро-5Н-пиррол[3,4-Ь]пиразин-5-ону. Методика характеризуется высокой чувствительностью. Предельно обнаруживаемая концентрация в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 45-450 а.е. составляет 70 нг/мл. Приведены хромато-масс-спектрометрические данные различных производных продукта гидролиза зопиклона, которые могут применяться для качественной идентификации этого соединения. Исследована сохраняемость зопиклона и его метаболитов при хранении в течение 1, 3 и 6 мес. образцов мочи лиц, принимавших терапевтические дозы этого вещества.
Зопиклон, синоним RP-27267, торговые наименования: Имован, Imovan, Rhovane, Sopivan, Zimo-vane, Zopiclone. Химическое название: 6-(5-хлор-2-пиридил)-7-оксо-6,7-дигидро-5Н-пиррол[3,4-Ь]пиразин-5-ил-4-метил-1-пиперазинкарбоксилат, является снотворным средством средней продолжительности действия. Ускоряет наступление сна и увеличивает его продолжительность [1]. Биодоступность при приеме per os порядка 80%; связь с белками плазмы от 45 до 80%; период полувыведения (Г1/2) от 3.5 до 6.5 ч [2-4]. Зопиклон быстро и широко распределяется в тканях, включая мозг. Метаболизирует в печени с образованием неактивного N-дезметильного производного и активного N-оксида зопиклона. Выводится с мочой, слюной и грудным молоком. Менее 7% препарата выводится в неизменном виде почками. Порядка 30% принятой дозы выводится с мочой в виде N-дезметилзопиклона и N-оксида зопиклона.
В связи с ростом злоупотребления зопикло-ном, Нордгрен и соавторы [5] отмечают, что методы для скринингового анализа зопиклона в моче разработаны недостаточно. Вследствие этого ими предложено определять зопиклон и его метаболиты жидкостной хроматографией с УФ-де-тектированием, а для подтверждения использовать масс-спектрометрическое детектирование. В работе Хомова Ю.А. с соавторами [6] приведена химико-токсикологическая характеристика зопиклона (имована) по данным методов микрокристаллоскопии, ТСХ, обращенно-фазной ТСХ, ВЭЖХ, УФ- и ИК-спектроскопии, газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектиро-
ванием. В работе [7] предложена хромато-масс-спектрометрическая методика скрининга ряда новых антидепрессантов, нейролептиков, снотворных лекарств и их метаболитов в моче, включая зопиклон. Предложенная методика включает кислотный гидролиз мочи, жидкость-жидкостную экстракцию при рН 8-9, ацетилирование и газо-хроматографическое разделение. Низкие концентрации зопиклона при скрининге определялись только при передозировке. В связи с трудностями в обнаружении и количественном определении зопиклона в работе [8] была предложена быстрая методика идентификации зопиклона по продукту деструкции 2-амино-5-хлорпиридину с использованием жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором и подтверждением методом хромато-масс-спектрометрии.
Нами разработана хромато-масс-спетрометри-ческая методика идентификации и количественного определения суммы зопиклона и его основных метаболитов в моче по общему для них продукту гидролиза - 6-(5-хлор-2-пиридил)-7-гидрокси-6,7-дигидро-5Н-пиррол[3,4-Ь]пиразин-5-ону.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Оборудование. Использовали газовый хроматограф Agilent 6850 с масс-селективным детектором Agilent 5973N (Agilent, США) и капиллярной кварцевой колонкой HP-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0.25 мкм. В работе применяли также термоблок ПЭ-4030 (ОАО "Экрос", Рос-
сия) и рН-метр HI 1290 (Португалия). Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 0.004-0.04, 0.04-0.2, 0.2-1.0 и 1.0-5.0 мл.
Материалы. Все растворители и реактивы имели чистоту х.ч.; использовали также гидрохлорид этилморфина (ГФ X, ФС 41) и зопиклон (порошок-субстанция, Испания, НД 42-10257-99). Исследовали образцы мочи двух добровольцев после приема per os терапевтической дозы 7.5 мг зо-пиклона. Моча субъекта А общим объемом 460 мл была получена спустя 10 ч после приема. Моча субъекта Б общим объемом 195 мл - через 12 ч. Образцы мочи хранились при +4°С.
Пробоподготовка мочи: 2 мл мочи помещали в стеклянный флакон объемом 10 мл, вносили 50 мкл спиртового раствора этилморфина гидрохлорида с концентрацией 0.02 мг/мл (внутренний стандарт) и добавляли 0.4 мл конц. HCl. Флакон плотно укупоривали и выдерживали в термоблоке при 100°С в течение 5 мин. Флакон охлаждали, прибавляли к гидролизату 25% раствор NH3 до рН 9-10 (по универсальной индикаторной бумаге) и экстрагировали смесью хлороформ - бутанол-1 (6 : 1) дважды по 5 мл. Экстракты фильтровали через бумажный фильтр с небольшим количеством безводного сульфата натрия. Полученные растворы выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха. К сухому остатку прибавляли 40 мкл пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида. Полученную смесь переносили в сосуд на 2 мл для аналитических проб, который плотно укупоривали и выдерживали в термоблоке при 80°С в течение 25 мин. Избыток реагентов удаляли в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата и 1 мкл полученного раствора вводили в хромато-масс-спектрометр с использованием устройства для автоматического ввода проб. Режим работы этого устройства включал следующие операции: три промывки шприца этанолом; три промывки этилацетатом; одна промывка шприца раствором пробы; три прокачки раствором пробы перед вводом ее в хромато-масс-спектрометр; набор и ввод пробы; три промывки шприца этанолом; три промывки этилацетатом.
Режим работы хромато-масс-спектрометра был следующим. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку составляла 1.5 мл/мин, режим работы узла ввода пробы включал деление потока 1:10 с задержкой включения на 1 мин после ввода пробы. Температура узла ввода пробы и линии соединения с масс-спектрометром 250 и 280°С. Начальная температура колонки была 70°С в течение 2 мин и далее колонку нагревали до 280°С со скоростью 20 град/мин с выдержкой при конечной температуре 8 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали на 200 В выше величины, полученной при стан-
дартной автоматической настройке детектора. Регистрировали масс-спектры в режиме полного сканирования ионов в интервале массовых чисел 45-450 а.е.
Градуировочный график зависимости соотношения площади ацетилированного продукта гидролиза зопиклона к площади внутреннего стандарта от концентрации зопиклона строили по результатам анализа интактной мочи, к которой добавляли спиртовой раствор зопиклона. Использовали образцы мочи с концентрацией зопиклона: 0.1; 0.5; 1.0; 5.0; 10.0 мкг/мл. Для каждой калибровочной точки проводили по три определения. Пробы готовили по описанной общей схеме анализа. Хромато-масс-спектрометрическое исследование калибровочных проб проводили в режиме селективного ионного мониторинга. Характеристические ионы для определения ацетилированного продукта гидролиза зопиклона с величинами m/z: 261, 263, 304, для ацетилированного этилморфина -(внутреннего стандарта) m/z: 296, 355. Градуировочный график строили с использованием площадей пиков ионов на хроматограммах с величинами m/z 261 и 296. Параметры удерживания были следующими: ацетилированный продукт гидролиза зопиклона 12.81 мин (индекс удерживания - RI 2480), ацетилированный этилморфин 13.63 мин (индекс удерживания - RI 2647). График был линейным во всем изученном диапазоне концентраций. Коэффициент корреляции составил 0.996.
Предельно обнаруживаемая концентрация в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 45-450 а.е. составляла 70 нг/мл, а в режиме селективного ионного мониторинга - 40 нг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Термическая и химическая лабильность зопиклона создает серьезные трудности при выполнении анализа с применением газовой хроматографии. На результаты влияют условия пробоподго-товки (рН среды, растворитель пробы и др.), температурные режимы узла ввода и колонки, эффекты старения колонки и загрязнения узла ввода.
Предварительное исследование эффективности извлечения зопиклона из 2 мл воды (при рН 9 по универсальной индикаторной бумаге) с концентрацией 1 мкг/мл и этилморфина гидрохлорида в концентрации 0.5 мкг/мл методом хромато-масс-спектрометрии показало, что зопиклон плохо извлекается с помощью ряда растворителей, традиционно применяемых для жидкость-жидкостной экстракции (табл. 1).
Ранее, в связи с трудностями определения зопиклона, предлагались варианты определения продуктов его гидролиза [7, 8]. Однако 2-амино-5-хлорпиридин имеет неудовлетворительные га-зохроматографические характеристики, а при
Таблица 1. Результаты исследования эффективности экстракции зопиклона и этилморфина из воды различными экстрагентами (п = 1)
Соединение Степень извлечения зопиклона и этилморфина из воды, %
Этилацетат Хлороформ Хлороформ-бутанол-1 (6 : 1) Метиленхлорид-бутанол-1(1: 1)
Зопиклон Этилморфин 0 73 3.6 101 7.6 114 3.7 92
определении в процессе общего скрининга [7] зопи-клон обнаруживается лишь при передозировках, что является следствием разрушения 6-(5-хлор-2-пиридил)-7-гидрокси-6,7-дигидро-5Н-пиррол[3,4-Ь]пиразин-5-она при длительном гидролизе.
Перспективные для анализа соединения, образующиеся при гидролизе зопиклона (I) и его основных метаболитов (II, III), представлены на рис. 1.
Изучение поведения зопиклона в водных растворах в условиях различных вариантов гидролиза показало, что в щелочной среде (2.5%-ный раствор гидроксида на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.