ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 10, с. 1057-1062
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.544
ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ НА СУЛЬФОКАТИОНООБМЕННОМ СОРБЕНТЕ
© 2007 г. М. С. Вакштейн, А. В. Иванов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы Поступила в редакцию 16.06.2006 г., после доработки 10.10.2006 г.
Для формирования восходящих градиентов рН внутри колонки, заполненной сульфокатионообмен-ным сорбентом, предложены простые подвижные фазы, содержащие не более двух активных компонентов. Наиболее плавные, практически линейные градиенты рН получены при использовании лимонной кислоты и Трис или №Н2Р04 и Трис в качестве активных компонентов элюента и создании ионной силы (до 0.1-0.3) в стартовом растворе или элюенте; однако при УФ-детектировании предпочтительнее использовать КаН2Р04 из-за более низкого светопоглощения. Показаны возможности предложенного подхода для хроматофокусирования смесей пептидов на сульфокатионообменном сорбенте. Добавки ацетонитрила в подвижные фазы повышают селективность разделения пептидов.
Традиционно в хроматофокусировании - методе разделения биполярных биологических макромолекул - градиенты рН создают внутри ионообменных колонок, обладающих значительной буферной емкостью [1, 2]. Слайтерман, разработавший метод хроматофокусирования, считал, что формирование градиента происходит за счет того, что ионообменный сорбент (предварительно приведенный в равновесие со стартовым буферным раствором) постепенно титруется буферным элюентом, и чем выше буферная емкость системы в целом, тем более плавный и линейный градиент рН формируется внутри колонки [3, 4]. Как правило, нисходящие градиенты рН формируют в колонках, заполненных слабоосновными ани-онообменниками с привитыми первичными и вторичными аминогруппами. Для формирования восходящих градиентов рН в качестве сорбентов используют слабокислотные катионообменники с карбоксильными группами. Сильнокислотные или сильноосновные ионообменные сорбенты практически не обладают буферной емкостью, и поэтому принято считать, что они не пригодны для использования в хроматофокусировании [5].
Однако еще в 1986 г. появилась работа [6], в которой были предприняты попытки сформировать нисходящий градиент рН внутри сильноосновной анионообменной колонки. Статья носила чисто теоретический характер и примеров практического приложения не содержала. В 20042005 гг. предложен вариант хроматофокусирования на сильнокислотных катионообменниках с восходящим градиентом рН [7, 8]. В этих работах приведены примеры разделения смесей белков и трипсиновых олигопептидов при использовании полиамфолитного элюента (т.н. "полибуфера").
Однако детектирование неароматических пептидов ниже 254 нм затруднено из-за использования полиамфолитных буферных элюентов, интенсивно поглощающих в этой области спектра. Кроме того, полибуферы обладают и другими недостатками: они легко подвергаются биодеградации под действием бактерий, а синтез таких соединений достаточно сложен и дорогостоящ. Все это делает актуальным поиск простых элюентов, содержащих не более двух-трех активных (рН-опреде-ляющих) компонентов для замены полибуферов при формировании градиентов рН.
Ранее нами были выбраны простые подвижные фазы на основе лимонной кислоты и Трис для формирования нисходящих [9] и восходящих [10] градиентов рН на карбоксильных катионооб-менных сорбентах. Установлено, что ионная сила подвижных фаз существенно влияет на профиль градиентов рН, формируемых внутри как слабоосновных [11], так и слабокислотных колонок [911]. Варьируя не только состав и природу активных компонентов, но и ионную силу подвижных фаз, можно получать градиенты рН различной формы [11]. При правильном выборе ионной силы стартового раствора и элюента в слабых ионообменных системах удается сформировать достаточно протяженные линейные или квазилинейные градиенты в интервале рН до 3-4 ед., а иногда и больше. Наряду со снижением стоимости метода можно ожидать, что использование простых элюентов облегчит УФ-детектирование при длинах волн, близких к 200 нм, где поглощает пептидная связь. Таким образом, можно ожидать детектирования всех пептидов, а не только ароматических.
Рис. 1. Формирование градиента рН цитратным буферным элюентом. Колонка: Hamilton PRP-X200. Стартовый раствор: 10 мМ лимонная кислота + Трис (рН 3.0). Элюент (рН 7.0): 1 - 10 мМ лимонная кислота + Трис, 2 - 5 мМ лимонная кислота + Трис, 3 - 5 мМ лимонная кислота + 4 мМ Трис + 0.05 М NaCl.
Цель работы - формирование восходящих градиентов рН простыми элюентами на сульфокати-онообменном сорбенте и применение полученных градиентов для разделения смесей пептидов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали хроматографиче-скую систему, включающую насос высокого давления LC-10 AT (Shimadzu, Япония); инжектор Rheo-dyne 7125 (США) с объемом петли 100 мкл; стальную хроматографическую колонку (250 х 4.1 мм), заполненную сульфокатионообменником; спек-трофотометрический детектор MicroUvis 20 (Carlo Erba Instruments, США); цифровой рН-метр HM-20S (TOA Electronics, Япония) с комбинированным стеклянным электродом GST-5211C и проточной ячейкой. Сигналы детекторов регистрировали на персональном компьютере с АЦП и обрабатывали с помощью программы "Мульти-хром 1.52" (Амперсенд, Россия).
Хроматографическая колонка. Использовали колонку PRP-X200 (Hamilton, США), заполненную полимерным катионообменным сорбентом на основе полистиролдивинилбензола с привитыми сульфогруппами, размер частиц 10 мкм, матрица сорбента устойчива при рН 0-13 [12]. Данные по ионообменной емкости производитель не указывает. Колонка любезно предоставлена д.х.н. П.Н. Не-стеренко (кафедра аналитической химии МГУ).
Реагенты и растворы. В качестве активных компонентов стартовых растворов и элюентов использовали лимонную кислоту (Реахим, Россия), Трис (Merck, Германия) и NaH2PO4 (Реахим, Россия). Необходимую кислотность растворов со-
здавали добавлением HCl или NaOH. Для создания ионной силы в подвижных фазах добавляли рассчитанное количество 2 М раствора NaCl, приготовленного из фиксанала (Germed, ГДР). В ряде случаев в подвижные фазы добавляли до 10 об. % CH3CN (Химмед, Россия). В качестве образца использовали препарат человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Все используемые реактивы имели квалификацию ч. д. а. Трипсин предоставлен проф. А.П. Синицыным (кафедра химической эн-зимологии МГУ).
Методика получения трипсинового гидролиза-
та. Навеску ЧСА растворяли в 50 мМ буферном растворе Трис - HCl (рН 8.5). Раствор трипсина (1 мг/мл) готовили растворением трипсина в 1 мМ HCl. Для получения гидролизата смешивали трипсин и субстратный белок (2 мг/мл ЧСА) в массовом соотношении 1 : 25, образовавшуюся смесь оставляли на 24 ч в термостате при 37°С [7, 13].
Методика эксперимента. Пропускали стартовый раствор при рН 3.0 до приведения сорбента в равновесие (т.е. до совпадения рН на входе и выходе колонки) и установления постоянной базовой линии УФ-детектора, а затем меняли стартовый раствор на элюент (рН 7.0) и одновременно регистрировали сигналы рН-метра и УФ-детек-тора (214 нм). Пробу трипсинового гидролизата (смесь пептидов) вводили либо во время пропускания стартового раствора, либо после замены стартового раствора на элюент. Объемная скорость подвижных фаз составляла 1 мл/мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Подвижные фазы на основе лимонной кислоты
и Трис. Роль подвижных фаз - стартового раствора и буферного элюента - очень важна при создании градиентов рН в колонке с сульфокатионооб-менным сорбентом, не обладающем буферной емкостью. В качестве активных компонентов обеих подвижных фаз выбрали лимонную кислоту и Трис: лимонная кислота обеспечивает буферную емкость в области рН 3-6, а Трис - ближе к рН 7.
Для упрощения системы и понимания, как влияют отдельные компоненты подвижных фаз на профиль восходящего градиента, создали равную концентрацию лимонной кислоты и Трис в стартовом растворе и в элюенте (рис. 1, кривая 1). В течение 6-7 мин рН на выходе из колонки оставался постоянным после начала пропускания элюента, поэтому на рисунке приведены градиенты начиная с 6 мин. Полученный градиент линеен при рН 3.5-6.2, однако по времени линейный участок продолжается около 3 мин, что может оказаться недостаточным для аналитических или препаративных целей. Безусловно, на сильнокислотном катионообменнике невозможно создать достаточно протяженный по времени линейный
градиент, так как сульфогруппы сорбента практически не участвуют в протолитических равновесиях в этой области рН и оказывают небольшое сопротивление при переуравновешивании сорбента до другого значения рН. При разбавлении элюента в 2 раза и сохранении концентрации стартового раствора происходит только параллельное смещение градиента по оси абсцисс без изменения характерных участков (рис. 1, кривая 2). Однако при добавлении в элюент инертного компонента (т.е. явным образом не определяющего рН) - №С1 - до концентрации 0.05 М форма градиента становится более плавной. Линейный участок градиента рН продолжается от 3 до 6.5, угол наклона градиента заметно уменьшается, увеличивая время выхода до 7 мин (рис. 1, кривая 3).
Изученную систему (стартовый раствор - 10 мМ лимонная кислота + Трис, элюент - 5 мМ лимонная кислота + Трис + 0.05 М №С1) попытались применить для разделения пептидов, полученных трип-синолизом человеческого сывороточного альбумина. К сожалению, собственный сигнал цитратного элюента при рекомендованной для пептидов длине волны 214 нм [7, 8] оказался еще достаточно велик и осложнил УФ-детектирование большинства пептидов. Поэтому далее выбирали компоненты для подвижных фаз, имеющие буферную емкость в интервале создания градиента рН, с одной стороны, и низкое светопоглощение в УФ-об-ласти, с другой.
Фосфатные буферные подвижные фазы. Переход к стартовому раствору и элюенту, содержащим буферный раствор №Н2Р04 в качестве активного компонента, позволил решить проблему высокого уровня фонового поглощения и вместе с тем получить достаточно протяженный градиент рН. На перво
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.