ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 81, № 3, с. 477-481
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ
УДК 616.153.922-074
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ В ЖЕЛЧНЫХ КАМНЯХ
© 2007 г. Н. Ю. Третьяков*, А. С. Коростелев*, В. В. Батурин*, А. Л. Коркин**
*ГОУ ВПО "Тюменский государственный университет" E-mail: ntretyakov@utmn.ru **ГОУ ВПО "Ханты-Мансийский государственный медицинский институт"
Разработана простая одностадийная методика определения свободного холестерина и насыщенных жирных кислот в желчных камнях, требующая минимальных затрат биологического материала. Использованы методы газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Извлечение липидов из желчных камней проведено при помощи жидкостной и микроволновой экстракции.
Желчнокаменная болезнь - патологический процесс образования камней в желчном пузыре, основу которых составляет холестерин. Определение содержания холестерина не дает диагностической информации о конкретном заболевании, а характеризует общую патологию обмена липидов. Известно много методов определения нейтральных липидов в биологических жидкостях. В последнее время в анализе липидов в целях изучения их состава и свойств разрабатываются новые методы их разделения, идентификации и количественного определения. Обзор методик определения холестерина представлен в работе [1].
Интенсивное развитие биохимии в течение последних двух десятилетий поставило перед аналитиками задачу разработки новых высокоселективных и особо точных методов анализа.
Исследуемый биологический объект - желчные камни (ЖК) - смесь трудноразделимых веществ различной химической природы, основной компонент которой - холестерин с примесями высших жирных кислот, желчных кислот, фос-фолипидов, билирубина, белка и т.д. Кроме того, вся проба находится в конденсированном состоянии. В литературе представлен широкий арсенал инструментальных методов определения холестерина в сыворотке и плазме крови - фотометрические [1], флуориметрические [2], электрохимические [1], ферментативные [3], хроматогра-фические [1, 4, 5]. Однако все они требуют проведения дополнительной пробоподготовки.
Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) отличается высокими метрологическими характеристиками. Однако, хотя данный метод рекомендован для клинического определения холестерина в биологических жидкостях (плазма, желчь), пока он не получил широкого распространения [1, 5]. Использование ГЖХ сдерживает как отсут-
ствие приборов в медицинских учреждениях, так и трудоемкость пробоподготовки, предусматривающей экстракционное разделение и деривати-зацию липидов [6]. Для превращения ГЖХ в удобный клинический микрометод определения холестерина требуется в первую очередь упростить процедуру подготовки пробы.
Длительное время клинико-диагностическая лабораторная служба обладала большим выбором фотометрических методов определения холестерина в биологических жидкостях человека. В настоящее время наблюдается тенденция совершенствования хроматографических методов (ГЖХ и ВЭЖХ), обладающих высокой чувствительностью, селективностью и точностью определения липидов в биологическом материале. ГЖХ - очень точный количественный метод определения холестерина и стеринов вообще, поскольку он обладает высокой разрешающей способностью при разделении близких по свойствам стеринов и имеет чувствительность, достаточную для их определения при решении большинства аналитических задач, даже при использовании стандартных детекторов [1, 4]. Методом ГЖХ можно раздельно определять как свободный холестерин и его эфиры, так и общий холестерин после щелочного гидролиза эфиров. Как правило, применяют пламенно-ионизационный детектор. Идентификацию соединений проводят с использованием различных веществ в качестве внутреннего стандарта.
В последнее время в анализе липидов в целях изучения их состава и свойств разрабатываются новые методы их разделения, идентификации и количественного определения. Разработка надежной методики определения холестерина и высших жирных кислот в желчных камнях человека - цель настоящего исследования.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Желчные камни (12 образцов), извлеченные у пациентов в декабре 2005 г., имели округлую или неправильную форму. Цвет камней изменялся от серебристо-серого до черно-коричневого. В качестве растворителя для экстракции липидов из ЖК использовали хлороформ, стабилизированный этанолом (1%) марки "для хроматоргафии". Для определения суммарного содержания нейтральных липидов в ЖК (по растворимости в хлороформе) растворяли навески камней (от 10 до 120 мг) и по убыли массы определяли количество липидов, перешедших в раствор. В микроаппарате Соксле-та проводили растворение липидов раздробленных камней, помещенных в стаканчик из фильтровальной бумаги (пробы № 2-13) горячим (кипящим) хлороформом в течение 45 мин. Окраска растворов менялась от бледно-желтой до желто-зеленой.
Хромато-масс-спектрометрические исследования экстрактов камней проводили на хроматографе Agilent 6850 с масс-селективным детектором 5972N в режиме электронной ионизации (70 эВ). Анализ проводили на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS длиной 25 м, внутренним диаметром 0.25 мм, с толщиной пленки неподвижной фазы 25 мкм. Скорость газа-носителя (гелия) -1 мл/мин. Температура испарителя - 290°С, температура переходной камеры - 230°С, температура квадруполя - 150°С. Температура термостата колонки изменялась по программе: 70 (задержка 1 мин) до 275°С со скоростью 25 К/мин. Общее время анализа составляло 35-40 мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл.
Количественное определение концентрации холестерина и жирных кислот проводили на газовом хроматографе "Кристалл 2000М", с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). В качестве внутреннего стандарта использовали метиловые эфиры арахидоновой кислоты (для определения жирных кислот) (СТ-1) и бегеновой кислоты (для определения холестерина) (СТ-2) (реактивы Analytic Standards фирмы PolyScience Corporation). Разделение компонентов проводили на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS. Температура испарителя - 290°С, температура детектора - 300°С. Программируемый режим термостата колонки -70 (задержка 1 мин) - 265°С (линейная скорость подъема температуры - 25 К/мин). Линейная скорость газа-носителя (азот) - 25 см/с. Применяли вариант ввода пробы с делением потоков. Коэффициент деления составлял 1 : 15.
Для определения относительных градуировоч-ных коэффициентов была приготовлена серия растворов жирных кислот: миристиновой (МК), пальмитиновой (ПК), стеариновой кислот (СК), холестерина и стандартов СТ-1 и СТ-2.
Навески жирных кислот МК (1.75 мг), ПК (1.15 мг), СК (1.20 мг) и 1.60 мг метилового эфира арахидоновой кислоты (СТ-1) растворяли в 1 мл хлороформа. Полученный раствор анализировали и рассчитывали относительные градуировоч-ные коэффициенты (п = 4). Для кислот получили коэффициенты: КМК = 0.907, КПК = 1.377, КСК = = 2.175 (Кст-1 = 1).
Для определения концентрации холестерина были приготовлены четыре градуировочных раствора с концентрацией: 0.40, 0.95, 1.40 и 2.10 мг/мл, содержащие одинаковую концентрацию СТ-2 (1.011 мг/мл). Проводя хроматографический анализ раствора, определили относительный градуи-ровочный коэффициент для холестерина (КХС = = 1.245) как среднее арифметическое четырех измерений. Для стандарта СТ-2 значение КСТ-2 = 1.
Для выделения холестерина из желчных камней использовали метод колоночной хроматографии. Для этого брали навеску камней ~300 мг, растворяли в хлороформе и переносили раствор в колонку, заполненную силикагелем (колонка длиной 25 см, диаметром 1 см, масса сорбента - 10 г, элюент - смесь диэтилового эфира и петролейно-го эфира в соотношении 20 : 80 (по объему)). Общий объем элюента составил 150 мл. Отбирали фракции по 5 мл. Из объединенных фракций, содержащих холестерин, удаляли растворитель и проводили перекристаллизацию из смеси этанол-гексан. В результате очистки были получены образцы холестерина с содержанием основного компонента 99.8% (метод ГЖХ, процентная нормализация), температура плавления 144-146°С (148.5°С [7]). Угол вращения (1%-ный раствор в диэтиловом эфире) +179.9° (длина волны натрия).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Определение доли растворимой части ЖК. После процедуры растворения и высушивания фильтровальных стаканчиков, определения их массы до и после экстракции, был установлен процент нерастворимого остатка. В табл. 1 представлены экспериментальные данные определения растворимой (липидной) части ЖК № 2-13. В этом и во всех последующих экспериментах проводили холостые опыты (без образцов желчных камней). Как видно из табл. 1, растворимость камней в хлороформе меняется от 1 до 99 %. Низкая растворимость липидов в некоторых образцах ЖК может быть связана с образованием кальциевых солей липидов. Образцы камней № 9, 5, 10 были подвергнуты более глубокому исследованию методами ГХ, ГХ/МС, в этих образцах концентрация липидов составила 5; 15 и 98% соответственно (табл. 1).
Определение качественного состава липидов методами ГХ/МС. Качественную идентифика-
цию компонентов растворимой части желчных камней проводили методом хромато-масс-спек-трометрии, по сопоставлению экспериментальных и библиотечных масс-спектров. Анализ спектров показал, что основным компонентом на хро-матограммах является холестерин (Но1ез1его1) (время удерживания 14.6 мин). По интенсивности сигналов холестерина в экстрактах желчных камней можно сделать предварительные выводы о его высоком содержании в образцах камней № 2, 6, 7, 8, 10, 11, 12; среднем содержании в ЖК № 3, 5, 13 и очень низком содержании в образцах № 4, 9. Из каждой группы для детального анализа отобрали образцы растворов камней № 9, 5 и 10 (с возрастанием концентрации холестерина и процента растворимой части).
На рис. 1 представлен экспериментальный масс-спектр холестерина, который совпал с его спектром из библиотеки спектров. В экстрактах желчных камней № 9, 5 и 10 кроме холестерина обнаружены жирные кислоты - МК, ПК, СК. Экспериментальные масс-спектры кислот совпали со спектрами библиотеки Ш8Т. В образце № 9 относительные площади пиков всех компонентов одного порядка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.